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関連審決 不服2020-13
この判例には、下記の判例・審決が関連していると思われます。
審判番号（事件番号） データベース 権利
令和4ネ10002特許権侵害差止請求控訴事件 判例 特許
令和2行ケ10144 審決取消請求事件 判例 特許
令和3行ケ10021 審決取消請求事件 判例 特許
令和2行ケ10079 審決取消請求事件 令和2行ケ10083 審決取消請求事件 判例 特許
令和4ネ10003特許権侵害差止請求控訴事件 判例 特許
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事件 令和 3年 (行ケ) 10129号 審決取消請求事件
5
原告 ツールゲンインコーポレイテッド
同訴訟代理人弁護士 奥村直樹 10 同西村英和
同訴訟代理人弁理士 田代玄
同 滝澤敏雄
被告特許庁長官 15 同指定代理人長井啓子
同 上條肇
同 井上千弥子
同 宮岡真衣
裁判所 知的財産高等裁判所
判決言渡日 2022/12/21
権利種別 特許権
訴訟類型 行政訴訟
主文 20 １ 原告の請求を棄却する。
２ 訴訟費用は原告の負担とする。
３ この判決に対する上告及び上告受理申立てのための付加期間を３０日と定める。
事実及び理由
全容
25 第1 請求 特許庁が不服2020-000013号事件について令和3年6月8日に 1 した審決を取り消す。
第2 事案の概要 本件は、特許拒絶査定の不服審判請求を不成立とした審決の取消訴訟である。
1 特許庁における手続の経緯等(当事者間に争いがない。) 5 ? 原告は、平成29年8月10日、名称を「標的DNAに特異的なガイドR NAおよびCASタンパク質コード核酸またはCASタンパク質を含む、標 的DNAを切断するための組成物、ならびにその使用」とする発明について、
特許出願(特願2017-155410号。平成25年10月23日〔パリ 条約による優先権主張 平成24年10月23日米国 平成25年3月2010 日米国 平成25年6月20日米国〕を国際出願日とする特願2015-5 38033号の一部を新たな特許出願としたもの。 「本件出願」 以下 という。
請求項の数41)をし、平成30年9月14日付けの拒絶理由通知を受けた ことから、平成31年3月25日、手続補正書を提出したが(以下、この手 続補正書による補正を「本件補正」という。 、令和元年8月26日付けの拒 )15 絶査定を受けた。
? 原告は、令和2年1月6日、拒絶査定不服審判請求をし、特許庁は、上記 請求を不服2020-000013号事件として審理を行い、令和3年6月 8日、「本件審判の請求は、成り立たない。」との審決(以下「本件審決」と いう。附加期間90日)をし、その謄本は、同月29日、原告に送達された。
20 ? 原告は、令和3年10月25日、本件審決の取消しを求める本件訴訟を提 起した。
2 特許請求の範囲の記載 本件補正後の請求項1の発明(以下「本願発明」という。)に係る特許請求の 範囲の記載は、次のとおりである。
25 真核細胞における標的デオキシリボ核酸(DNA)の切断のためのタイプU のクラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列(CRISP 2 R)/Caｓシステムを含む組成物であって、該CRISPR/Caｓシステ ムが (i)Caｓ9ポリペプチドおよび核局在化シグナルをコードする核酸、また は核局在化シグナルを有するCaｓ9ポリペプチド、および 5 (A)真核細胞中の標的DNAにハイブリダイズするガイドRNAまたは該ガ イドRNAをコードする核酸、
を含み、ガイドRNAがトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)配列 に融合したCRISPR RNA(cｒRNA)配列を含むキメラガイドRN Aであり、該cｒRNA配列が該ｔｒacｒRNA配列に対して5′末端側に10 ある、上記組成物。
3 本件審決の理由の要旨 本件審決は、本願発明は、本件出願の第1の優先日である平成24年10月 23日(以下「本願第1優先日」という。)より前に日本国内又は外国において 頒布等された甲第20号証「A ｐｒｏgｒammable Dｕal-RNA-Gｕided DNA15 Endｏnｕcleaｓe in Adaｐｔive Bacｔeｒial Immｕniｔｙ、Science、 Aｕg 2012、
Vｏl.337、 ｐ.816-821 & Sｕｐｐlemenｔaｒｙ Maｔeｒialｓ」(以下「引用文献 1」という。別紙2参照)に記載の発明(以下「引用発明」という。)と周知技 術に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから、本件出願 は拒絶すべきものと判断した(以下、本件出願に係る願書に添付した明細書を、
20 図面を含めて「本願明細書」という。別紙1参照)。
その判断の要旨は以下のとおりである。
? 引用発明の認定 クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復(CRIS PR)/CRISPR関連(Caｓ)系を含む組成物であって、
25 (a)U型Caｓ9タンパク質、及び (b)cｒRNAの3′末端側にｔｒacｒRNAの5′末端側が融合したキ 3 メラRNA を含み、キメラRNAと塩基対を形成する、プラスミド中の標的DNAを緩 衝液中で切断するための組成物。
? 本願発明と引用発明との一致点 5 標的デオキシリボ核酸(DNA)の切断のためのタイプUのクラスター化 された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列(CRISPR)/Caｓ システムを含む組成物であって、該CRISPR/Caｓシステムが (i)Caｓ9ポリペプチド、および (A)標的DNAにハイブリダイズするガイドRNA、
10 を含み、ガイドRNAがトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)配 列に融合したCRISPR RNA(cｒRNA)配列を含むキメラガイド RNAであり、該cｒRNA配列が該ｔｒacｒRNA配列に対して5′末 端側にある、上記組成物。
? 本願発明と引用発明との相違点15 ア 相違点1 本願発明は、
「真核細胞」における標的DNAを切断するための組成物で あって、Caｓ9ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有しているのに 対して、引用発明は、
「緩衝液中」の標的DNAを切断するための組成物で あって、Caｓ9ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有していない点。
20 イ 相違点2 本願発明は、Caｓ9ポリペプチド及びガイドRNAが、それらをコー ドする核酸である態様も含まれているのに対し、引用発明は、そのような 態様が含まれていない点。
? 相違点の容易想到性25 ア 相違点1 引用文献1においては、CRISPR/Caｓ9系をゲノム編集に利 4 用する可能性が強調され(816頁要約) ゲノムを操作するための人工 、
酵素として大きな関心を集めたジンク-フィンガーヌクレアーゼ(以下 「ZFN」という。 や転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ ) (以下「T ALEN」という。)を例示した上で、CRISPR/Caｓ9系が遺伝 5 子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大きな潜在能力をもた らし得る代替的な手法として提案されている(820頁右欄2ないし9 行目)。
本願第1優先日当時、ゲノム編集の主たる対象は真核細胞であって、
ZFNやTALENが真核細胞中の標的DNAすなわち核内のゲノムを10 切断するものであることは周知であったから(甲21ないし24、25 の1及び2、26の1及び2) 引用文献1の記載に接した当業者にとっ 、
て、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞の核内のゲノムに 対して機能させようと試みることは、ごく自然な発想である。また、本 願第1優先日当時、タンパク質や核酸を真核細胞へ送達する各種手段は15 周知であり(甲25の1及び2、26の1及び2)、タンパク質を真核細 胞の核内に移行させるための手段も周知であったから(甲27ないし2 9) 当業者が前述のごく自然な発想を抱くことを妨げる特段の事情があ 、
ったとはいえない。
したがって、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を、真核細胞にお20 ける標的DNAの切断に用いることは当業者が容易に想到し得ることで あり、その際に、真核細胞の核内に移行させるための常套手段である核 局在化シグナルを引用発明のCaｓ9ポリペプチドに付加することは、
当業者が格別の創意工夫なくなし得たことであるといえる。
イ 相違点225 本願第1優先日当時、細胞内で機能させるためのタンパク質やRNAを、
それらをコードする核酸の形態で細胞に導入することは常套手段であり、
5 また、そのような核酸を真核細胞へ送達する手段も周知であった(甲25 の1及び2、26の1及び2)。
そして、前記アで検討したとおり、引用発明のCRISPR/Caｓ9 系を真核細胞の核内のゲノムに対して機能させようとすることが十分に 5 動機付けられる以上、それらを構成する成分であるCaｓ9ポリペプチド 及びキメラRNAを、それらをコードする核酸の形態で導入することも、
当業者が適宜なし得たことにすぎない。
ウ 本願発明の効果について 本願明細書の記載を参酌しても、本願発明が、引用文献1に記載された10 発明及び本願第1優先日当時の周知技術からは当業者が予測できない顕 著な効果を奏するものとは推認できない。
4 取消事由 引用発明に基づく本願発明の進歩性判断の誤り 第3 当事者の主張15 1 原告 ? 相違点1の容易想到性判断の誤り ア 真核細胞における標的DNAに適用する点について 阻害要因 以下に阻害要因として掲記するとおり、原核細胞と真核細胞との間に20 は多くの相違点や隔たりが存在しており、このようなことから、本願第 1優先日当時、当業者は、原核細胞に由来するCRISPR/Caｓ9 系の適用は生体外系や原核細胞系等、真核細胞以外の系に制限されると 考える。
なお、被告は、引用文献1が実験材料そのものとして原核細胞や真核25 細胞を使っていない旨主張するが、引用文献1において用いられるプラ スミドが原核細胞に由来するDNAであるなど、使用されているシステ 6 ム自体が原核細胞由来のものであるという大前提には変わりはない。引 用文献1は、要するに、原核細胞に起源のあるシステムを僅かに改変し て緩衝溶液中のプラスミドに適用したというものであり、その改変は真 核細胞を意図したものではない。試験管内でのプラスミドを用いたDN 5 A cleaｖage(切断)試験は最も基本的なステップであって、むしろ原核 細胞のDNAをcleaｖage 切断) ( する試験よりも容易であるとさえいえる。
a 阻害要因1 Caｓ9ポリペプチドは、真核細胞の細胞質で発現され、細胞質に おいて正しく折り畳まれて適切なマルチドメイン構造を形成し、かつ、
10 ユビキチン経路のような、異常タンパク質を排除する真核細胞性タン パク質分解経路により分解されることなく安定性を保持する必要があ る(甲18、77)。すなわち、Caｓ9ポリペプチドを含め、一般的 にタンパク質は細胞核ではなく、細胞質と呼ばれる細胞内の領域で合 成されて、そこで機能できるような形に折り畳まれている。一方、C15 aｓ9ポリペプチドのように真核細胞内に本来的に存在しないタンパ ク質は、ユビキチン経路と呼ばれる真核細胞に存在するタンパク質分 解経路によって認識されて分解される可能性がある。それゆえ、CR ISPR/Caｓ9系が真核細胞内で機能するためにはこの分解経路 をすり抜ける必要が存在した。
20 しかしながら、本願第1優先日当時の当業者は、ガイドRNAと複 合体を形成する以前に、Caｓ9ポリペプチドが産生され、正しく折 り畳まれ、ユビキチン経路からの攻撃を回避し得るかを知るものでは なかった。本願第1優先日当時、タンパク質が、その本来の細胞では なく、他の細胞において発現される場合には、異なる折り畳みが生じ25 ることがあり、不完全に折り畳まれたタンパク質が活性を欠いたり、
異常機能を示したりして、ユビキチン経路により異常タンパク質と認 7 識され、分解され得ることがよく知られていた。
さらに、本願第1優先日当時の当業者は、天然のコドン使用頻度の 重要性を認識しており、コドンの変化がタンパク質の翻訳に動力学的 な変化を生じさせ、その結果、誤った折り畳みのせいでタンパク質の 5 活性を変化させ得ることも認識していた。すなわち、アミノ酸をコー ドするコドンの使用頻度は真核生物と原核生物とで異なり、その結果、
たとえコードされているアミノ酸が同じであっても、タンパク質生成 時におけるmRNAからアミノ酸により構成されているタンパク質へ の翻訳速度が変化することがあり、翻訳速度が遅いと早い段階で折り10 畳みが始まって本来とは違う形に折り畳まれることがあり、そうする とCaｓ9ポリペプチドの折り畳みに影響が出る可能性がある(甲1 8)。
被告は、分解等の懸念があるのであれば、核酸の導入量を増やすな どの実験の最適化を当業者は行う旨を主張するが、自らのものではな15 い異種タンパク質を大量に細胞内で発現させ、あるいは細胞内に導入 すれば、細胞に有害であることは明らかである。また、導入量を増や せばそれだけ、標的外のDNAを切断するオフターゲットの危険性も 上昇する。したがって、そのようなリスクの大きい手法を当業者が簡 単に講じることはできない。
20 b 阻害要因2 CRISPR/Caｓ9系を用いて真核細胞中のDNA切断を実現 するためには、ガイドRNAが真核細胞性のヌクレアーゼによる分解 を逃れる必要が存在した。すなわち、本願第1優先日当時の当業者は、
真核細胞の細胞質及び核がRNAを切断するエキソヌクレアーゼ等の25 リボヌクレアーゼ(RNaｓe)を含有しており、それらがRNAを 迅速に分解すること、また、CRISPR/Caｓ9系のガイドRN 8 Aが、かかるエキソヌクレアーゼ等により仲介される分解からRNA を保護するために真核細胞性RNAが用いる改変(例えば、RNAの 5′側における修飾である5′キャッピング及び3′側における修飾 である3′ポリアデニル化)を有しないこと、特に、ガイドRNAの 5 5′及び3′末端の両方が裸のままであると、端から順にRNAを切 断するエキソヌクレアーゼ等の攻撃の標的とされて分解されてしまう ことを認識していた(甲81の763頁)。さらに、本願第1優先日当 時の当業者は、ガイドRNAに対して、上記のヌクレアーゼ等からの 攻撃を緩和する改変を追加すると、そのような改変がかえってRNA10 をリボソームや他のタンパク質複合体のような真核細胞性構造体を動 員する役割を果たし、ガイドRNAとCaｓ9ポリペプチドとの複合 体形成を阻害すると理解していた。
また、当業者は、RNAを発現させるために、DNA上の領域であ るRNAポリメラーゼV(ｐｏl V)プロモーターを使用しようとする15 はずであるが、真核細胞においてｐｏl Vプロモーターから産生される ガイドRNAは、核又は仁(核小体)中の豊富にある分子シャペロン タンパク質(Laタンパク質)に結合され、それらに保持される。分 子シャペロンは、一般には他のタンパク質が正確な折り畳みを行うよ うに補助する分子であり、RNAの折り畳みにも関与する分子である20 が、分子シャペロンがその機能を発揮しようとしてガイドRNAに結 合すると、この分子シャペロンタンパク質は、ガイドRNAがCaｓ 9ポリペプチドと相互作用したり、ガイドRNAとCaｓ9ポリペプ チドが機能性CRISPR/Caｓ9複合体を形成することに干渉す ると当業者は理解していた(甲18)。
25 c 阻害要因3 CRISPR/Caｓ9系を活用して真核細胞の標的DNAを切断 9 するためには、ガイドRNA及びCaｓ9ポリペプチドが核内へと活 性を有した状態で輸送される必要があり、真核細胞性の遮断因子との 相互作用によって阻害されることなく近接して、複合体を形成する必 要がある。
5 しかしながら、当業者は、真核細胞に特有の区画化された構造(特 に核膜)が、CRISPR/Caｓ9系が真核細胞のDNAにアクセ スする上で顕著な追加の障害になると理解していた。すなわち、真核 細胞のDNAは、核内に折り畳まれており、それゆえ、DNAは細胞 質から核膜により物理的に隔離されている。一方、Caｓ9ポリペプ10 チドは細胞核とは異なる細胞質で生成され、細胞核内へのアクセスの ためには核膜という物理的障壁を通過する必要がある。このようなこ とから、当業者は、核膜のような物理的障壁のない原核細胞に由来す る引用文献1のCaｓ9ポリペプチドが、真核細胞の細胞質からその 核内へと移動し、次いでガイドRNAを見つけ出しそれと機能可能な15 正しい複合体を形成することが起きることについて否定的であった。
d 阻害要因4 CRISPR/Caｓ9複合体は、真核細胞のDNAがクロマチン に折り畳まれているにもかかわらず、DNAにアクセスした上で、真 核細胞のDNAを所望のように走査できる必要がある。
20 しかしながら、本願第1優先日当時、当業者は、細菌のDNAは原 核細胞内でいわば裸の状態で存在するので自由にアクセス可能である のに対して、真核細胞のDNAはクロマチン内に存在するため自由に アクセスすることが困難であると理解していた。これは、クロマチン がヒストンタンパク質等の真核細胞に特有の構成要素とDNAとが、
25 複雑に折り畳まれた、高度に充填された構造であり、それによって真 核細胞の巨大なDNAが核内に密に詰め込まれているからである(甲 10 82)。このような相違から、当業者は、真核細胞性ではない酵素や、
原核細胞性の部位特定基遺伝子標的化システム(CRISPR/Ca ｓ9系はこの一種である。を真核細胞で使用することは阻まれると認 ) 識していた(甲50、51、18)。
5 e 阻害要因5 真核細胞のゲノムは、比較的小さな原核細胞のゲノムや原核細胞に 作用するウイルスのゲノムと比較して顕著に大きく、かつ高度に充填 されたクロマチン構造として折り畳まれている。そして、真核細胞の ゲノムを切断する場合、CRISPR/Caｓ9系は、真核細胞の巨10 大なゲノム中にある、特異的なDNA標的配列を成功裏に認識し、そ れに結合する必要がある。
本願第1優先日当時、哺乳動物のゲノムは、CRISPR/Caｓ 9系が天然で機能するバクテリオファージのゲノムよりも、ゲノムサ イズが何桁も大きいことが知られていた。具体的には、ヒトゲノムの15 大きさは、約3.2ギガbｐ(3234メガbｐ)であるのに対して(甲 54) CRISPR/Caｓ9系の天然DNA標的を保有するバクテ 、
リオファージの一種であるT4ウイルスのゲノムは、約169キロb ｐであり、これはヒトゲノムの約1万9000分の1である。当業者 は、ゲノムサイズのこの顕著な違いから、原核細胞内で機能し、バク20 テリオファージのゲノム等を標的として進化してきたCRISPR/ Caｓ9系が、1万倍もサイズの大きい真核細胞のゲノム内で標的配 列にアクセスしそれを特異的に切断することは、不可能又は相当な困 難を伴うと認識していた(甲18)。
その上、CRISPR/Caｓ9系は、PAM配列(プロトスペー25 サー隣接モチーフ 5′―NGG―3′)に近い7ないし12塩基の みが特異性(狙った箇所のみを切断する性質)として重要であり(甲 11 93) 見かけ上のcｒRNA全体の長さよりも特異性が低い 、 (甲94、
95)。これは、原核細胞に由来するCRISPR/Caｓ9系は、本 来的には、比較的単純なゲノムしか持たないファージ(細菌に感染す るウイルスの一種)に対する免疫機構であるという性質上からである。
5 そして、このような特異性の低さから、ゲノムサイズの大きい真核生 物を標的とする場合には標的外のDNAを切断するオフターゲットの 可能性が高まることとなり、真核生物への適用は現実的ではないと認 識されていた。
f 阻害要因610 CRISPR/Caｓ9複合体を用いて真核細胞中のゲノムDNA を切断するためには、CRISPR/Caｓ9複合体が真核細胞内の 低濃度マグネシウムイオンという条件下でも酵素活性を維持する必要 がある(甲18) 本願第1優先日当時、
。 原核細胞と真核細胞(例えば、
哺乳動物細胞)とでは遊離マグネシウム濃度が大きく異なることが当15 業者には広く知られていた。そうすると、当業者は、低濃度のマグネ シウムイオン環境である真核細胞においては、CRISPR/Caｓ 9複合体を適用してDNAを切断することはできないものと認識する。
すなわち、CRISPR/Caｓ9複合体は、切断反応にマグネシ ウムイオンを必要とし、その活性もマグネシウム濃度に依存する。引20 用文献1にも、CRISPR/Caｓ9複合体が、1mMの場合より 2+ も、5mMというMg 濃度において有意により効果的に機能する ことを教示している(816頁右欄26ないし28行目、
SUPPLEMENTARY MATERIALS AND METHODS の「Plaｓmid DNA c 2+ leaｖage aｓｓaｙ」、図S4)。一方、真核細胞における細胞内Mg 濃25 度は、一般には1mM未満であり、例えば、典型的な哺乳動物細胞の 2+ 細胞内のMg 濃度は0.5mM程度である(甲18) これに対して、
。
12 引用文献1は、真核細胞がCaｓ9ポリペプチドが機能し得る十分な 量の遊離マグネシウムを含有することについては何ら開示していない。
しかも、引用文献1に係る実験は生体外(in ｖiｔｒｏ)で、高濃度のC aｓ9ポリペプチド及びDNAを使用して行われたものであるが、こ 5 のような条件は真核細胞内では生じ得ない。
そして、本願第1優先日当時、当業者は、本願発明と同様に原核細 胞性であり、エンドヌクレアーゼ(核酸切断酵素)を有するグループ Uイントロンシステムについての確立された先例を熟知しているとこ ろ、このグループUイントロンシステムは、特定の実験条件下で人工10 的に高レベルのマグネシウムイオンを添加した後に初めて、真核細胞 において機能したことが知られている(甲53の6頁左欄11ないし 15行目)。
そうすると、本願第1優先日当時の当業者は、グループUイントロ ンシステムの確立された先例や引用文献1の教示に基づき、CRIS15 PR/Caｓ9系は、グループUイントロンシステムの場合と同様に、
2+ Mg 条件の制限を受ける蓋然性が非常に高く、真核細胞の生理学 2+ 的Mg 濃度では効率的に機能しないと結論付けたものである。
g 阻害要因7 CRISPR/Caｓ9系が真核細胞で機能するためには、細胞毒20 性(細胞傷害性)の問題を克服する必要がある。
すなわち、ガイドRNAのような構造をもつRNAは一般に細胞に とって異物であり、有害であると認識されて細胞による攻撃の対象と なり得るから、これを真核細胞に導入することに伴う細胞毒性の可能 性がある。例えば、5′三リン酸を特徴とする構造化されたRNA分25 子は、RIG-Iのようなパターン認識受容体を活性化し、抗ウイル ス作用を示すインターフェロン産生の誘導(細胞性インターフェロン 13 応答)等の生来的な免疫応答を惹起することが知られていた(甲65 の1頁要約、甲83の997頁要約、甲84)。そして、構造化された RNAモチーフ、例えば、dｓRNA(二本鎖RNA)の領域は、真 核細胞内で種々のdｓRNA結合型タンパク質と相互作用し、細胞性 5 の抗ウイルス免疫機構の一部としてインターフェロン応答を惹起する ことが知られていた。
また、Caｓ9ポリペプチドは、限られた大きさしかない原核細胞 ゲノム内の固有の標的配列を認識するように天然において進化したも のであり、限られた配列特性しか要求されておらず、cｒRNA配列10 は一般には長くはないので、ゲノムサイズが大きい真核細胞において は、特異性の低いcｒRNAが誤った箇所を切断する可能性がある。
そのため、オフターゲットDNA配列(本来の標的ではないDNA配 列)に結合すること等により引き起こされる細胞毒性(細胞傷害性) の問題を克服する必要もある。当業者は、Cｒeレコンビナーゼ(バ15 クテリオファージ由来の遺伝子組換酵素)やCRISPR/Caｓ9 系のような原核細胞性の遺伝子編集システムを、より顕著に大きなゲ ノムサイズを有する真核細胞に導入する場合、真核細胞のゲノムはそ の大きさの違いに比例して、より多くの非特異的標的部位を有すると 予測され、それがランダムなオフターゲット活性及び細胞毒性をもた20 らすと予測する(甲18)。
被告は、オフターゲット切断がされても、細胞にはDNA修復機構 があるから引用発明の真核細胞への適用には支障がない旨主張するが、
細胞のDNA修復機構には限界があり、一定限度を超えれば本来の機 能が変化することは当業者にとって自明な事項である。あらゆるDN25 A切断がDNA修復機構によって容易に修復されるのであれば、そも そもゲノム編集自体が不可能である。
14 本願第1優先日当時における当業者の認識及び技術常識 a 本願第1優先日当時、真核細胞由来ではないシステム及び遺伝子を 真核細胞において機能させる数々の試みが失敗していたことが知られ ていた(甲18)。
5 T7 RNAポリメラーゼの事例 天然では原核細胞内で作動し、DNAからRNAへの転写を駆動 することにより遺伝子発現に関与するバクテリオファージ由来の 酵素であるT7 RNAポリメラーゼが、クロマチンにアクセスし、
クロマチンを構成するDNAからRNAを伸長する能力を欠くこ10 とから、真核細胞内では正しく機能し得ないことが知られていた (甲50ないし52)。
? グループUイントロンシステムの事例 グループUイントロンシステムの遺伝子標的化作用に対して、真 核細胞のクロマチンが顕著な障壁となることが知られていた。
15 さらに、グループUイントロンが機能するためには、人工的技術 によってしか真核細胞内で達成できない量の遊離マグネシウムが 必要であることも知られていた。
? リボスイッチの事例 mRNAの一部分であるリボスイッチは、リガンド(タンパク質20 等の生体物質と結合する物質)に応答して原核細胞内で遺伝子発現 (mRNAからタンパク質が製造されること)を制御するが、RN A構築物の折り畳みが試験管と細胞内とで異なる可能性があるこ となどから、当初は真核細胞内での遺伝子発現制御のための潜在的 なツールとして脚光を浴びたものの、有用な遺伝子発現を制御する25 スイッチとなることを妨げられたことが知られている(甲18、5 9の1190頁左欄下から5ないし4行目)。
15 ? リボザイムの事例 リボザイムは生化学反応を触媒するRNA分子であり、in ｖiｔｒｏ (生体外)では有効であったが、in ｖiｖｏ(生体内)では予測どおり機 能しなかった。これは、リボザイムが標的RNAへ結合することに 5 対する細胞内タンパク質の干渉、リボザイム機能に不十分な細胞内 イオン濃度及びRNAｓe(リボヌクレアーゼ)によるリボザイム への攻撃が理由であることが知られていた(甲18、60)。
b 当業者は、本願第1優先日当時、CRISPR/Caｓ9系が真核 細胞内で機能し得ることについては専ら否定的な見解を有していた。
10 本願第1優先日前後の文献には、本願第1優先日当時について、例 えば、 このような細菌系が真核細胞で機能するかどうかは知られてい 「 なかった。 (甲48の2頁) 「(この発表は)大きな成功であったが、
」 、
問題があった。我々には、CRISPR/Caｓ9系が真核生物-植 物及び動物細胞で機能するか否か確かではなかった。 甲49の4頁) ( 」 、
15 「Dｏｕdnaは、CRISPRをヒト細胞で機能させることについて「多 くの挫折」を経験し、これに成功すれば、CRISPRは「非常に大 きな発見」となることを知っていた。 (甲37の3頁) 「生物の遺伝 」 、
子の特定の要素を改変する能力は、ヒトの健康を含む生物学の理解を 進展させるために不可欠であった。
・・・しかし、動物およびヒトにお20 けるこれらの改変を行う技術は、ヒト治療学における研究および開発 の双方において巨大な障害となってきた。 (甲87の2頁) 「真核細 」 、
胞におけるシステムの活性はどうか? ジンクフィンガー及びTAL Eモジュールの双方は、クロマチン内の標的に結合する天然の転写因 子由来である。これはCRISPR成分には当てはまらない。Caｓ25 9ポリペプチドがクロマチン標的に対して効果的に作用すること、又 は必要なDNARNAハイブリッドがこの状況で安定化され得ること 16 について何の保証もない。この構造は、いずれもがRNA複製の際に RNAプライマーの除去のために機能するリボヌクレアーゼH及び/ 又はFEN1によるRNA加水分解の基質となり得る。真核生物にお けるシステムに適用する試みのみが、これらの懸念事項に対処するこ 5 とになるであろう。 (甲41の1660頁中欄9行目ないし右欄6行 」 目) 「私の見解では、2012年の時点において当業者が真核細胞に 、
おいてCRISPR-Caｓ9システムが機能することを予測できな かったであろうという直接的な同時期の証拠が、【A】 2012の発表後 の本技術分野の研究者らの同時期になされた言説と彼らの実施経過と10 いう形で存在する。 甲92の156ないし164段落) 昨日、B】 」 ( 「 、 【 にメールで伝えたように、
【C】のデータは、8月の最初の結果が再現 不可能であることが判明したけれども、論文にはなっておらず、その 後の実験に照らして、おそらく何らかのコンタミネーションがあった と思われる。 (甲96)等の記載がみられる。
」15 c 本件審決は、相違点1を想到する動機付けとなるとして以下の文献 の記載を引用するが、誤りである。
すなわち、甲第41号証(本件審決の参考資料5)には、
「試してみ る価値が明らかにある」との記載があるが、
「真核細胞」ということが 明示されているわけではないし、真核細胞へ適用するに当たって考え20 られる各技術的障害をいかに克服するかも何ら検討しておらず、単な る当業者の願望を記載したものにすぎない。また、甲第49号証(本 件審決の参考資料13)には、真核細胞において」 「 との記載はあるが、
本願第1優先日後の文献であり、これを根拠にして本願第1優先日当 時、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用しようとすることに25 動機付けがあったことが示唆されることはない。甲第48号証(本件 審決の参考資料12)も本願第1優先日の後の文献であり、その記載 17 内容も、バクテリアシステム(細菌系)で発見されたゲノム編集技術 が、真核細胞において機能することについては否定的な見解がとられ ていたことを示唆するものである。
ZFN及びTALENとCRISPR/Caｓ9系との相違 5 以下のとおり、ZFNやTALENといった従来技術の活用例から、
CRISPR/Caｓ9系を真核細胞へと適用することの動機付けを見 いだすことはできない。
ZFNは、真核細胞のゲノムDNAに結合するように自然に進化した ジンクフィンガーモジュールと、細菌由来であるがZFNが発明された10 時点でゲノムDNA配列を切断する機能が周知であったDNA切断酵素 であるFｏk1酵素とを人工的に結合させたものであり、TALENは、
真核細胞である植物細胞のゲノムDNA配列に結合するように自然に進 化した細菌タンパク質(TALエフェクター)に上記Fｏk1酵素を人 工的に結合させたものである(甲90)。ZFNやTALENは、切断す15 るDNAを認識するのも、DNAを切断するのもタンパク質である。ま た、Fｏk1酵素部分は二量体化が必要なため、ZFNやTALENは 2つの分子を設計して一組として使用する必要がある。そして、TAL ENで使用するTALENモジュールもZFNで使用するジンクフィン ガーも、真核細胞内のクロマチン環境の中で標的と結合する天然の転写20 因子及び天然の構造に由来しており、原核細胞には存在しないものであ って、原核生物の系を真核生物へと移植したものではない。
これに対して、CRISPR/Caｓ9系は、本来的に原核細胞に由 来するものであり、Caｓ9ポリペプチドは、真核細胞におけるDNA 配列と結合するために進化したものではなく、ウイルス配列を切断する25 ために進化したDNA切断酵素である。そして、CRISPR/Caｓ 9系は、ガイドRNAとCaｓ9ポリペプチドは直接結合しておらず、
18 非共有結合によって複合体を形成していて、ガイドRNAが切断するD NAを認識し、Caｓ9というポリペプチドがDNAを切断する。また、
DNAを切断するためにCaｓ9ポリペプチドの二量体化は不要なため、
2つの分子を設計する必要はなく、RNA-DNA相互作用を利用する 5 ことから、ガイドRNAがゲノムなDNAに結合する過程では、DNA の巻き戻し(DNAの二重らせん構造の開放)が行われる。
このように、TALENやZFNといった従来例と原核生物起源のC RISPR/Caｓ9系は関連性の低い技術である。
イ 核局在化シグナルの付加の点について10 細胞環境 引用発明の系の環境は、真核生物細胞の環境とは本質的に異なる。す なわち、本願第1優先日当時、核内移行シグナル(核局在化シグナル) を利用してポリペプチドを真核生物の核内に移行させる技術は知られて いたものの、その技術を採用することが動機付けられるのは、ポリペプ15 チドを核内に移行させ何らかの作用を奏させることが可能であることを 前提とする。そうすると、CRISPR/Caｓ9系は、核内に移行し、
そこでガイドRNAと複合体を形成しなければその作用を奏しないから、
核局在化シグナルをCaｓ9ポリペプチドに付することが動機付けられ るためには、Caｓ9ポリペプチドが核内に移行できるだけでなく、核20 内でガイドRNAと複合体を形成できることが想定される必要がある。
原核生物に起源する新しいシステムにおいて、Caｓ9ポリペプチドが 核内に移行できるか否か、核内に移行したCaｓ9ポリペプチドとガイ ドRNAとが機能可能に正確な複合体を形成し、さらに、引用文献1の ようなin ｖiｔｒｏ(生体外)の系と同様に標的DNAを切断する機能を示す25 ことができるかは、当業者であっても予測できたものではない。このよ うに、CRISPR/Caｓ9系は、Caｓ9ポリペプチドが核内に移 19 行するだけでなく、核内でガイドRNAと複合体を形成しないと機能し ない点で、ZFN及びTALENとは根本的に異なるものであるから、
単にCaｓ9ポリペプチドが核内に移行できさえすればよいというもの ではない。
5 サイズの相違 CRISPR/Caｓ9系とTALEN及びZFNとの間には、その サイズに大きな違いが存在し(甲89)、このようなサイズの違いから、
当業者は、ZFNやTALENにおいて核局在化シグナルの使用が動機 付けられたからといって、CRISPR/Caｓ9系においても同様に10 核局在化シグナルを用いることが動機付けられた、あるいは、当業者が その適用を創意工夫なくなし得たとはいえない。すなわち、従来技術と されるTALEN(分子量105kD以下)やZFN(分子量40kD 以下)と比較すると、Caｓ9ポリペプチド(分子量163kD)は、
そのタンパク質サイズが大きく、その分子の形状についてみても、Ca15 ｓ9ポリペプチドは球状構造であるのに対して、TALEN及びZFN は単純な反復構造(比較的伸びた形状)を有するものにすぎない。そし て、タンパク質は、核膜の穴を通して核内へと移行することが想定され るところ、TALENやZFNと比較して顕著にサイズが大きいCaｓ 9ポリペプチドが、これらの従来技術と同様に、核膜を通過して核内へ20 と移行することが当然に想定できるわけではない。
「容易の容易」 当業者が、相違点1に係る構成を想到して本願発明の構成に至るため には、まず、@原核細胞を対象とした引用発明について、対象を真核細 胞へと変更することを想到し、この構成の変更を前提にして、次に、A25 タンパク質の核内移行手段として核局在化シグナルを用いる、という2 つのステップを踏む必要がある(いわゆる「容易の容易」 。そして、こ ) 20 のように主引用発明から2つの段階を経てようやく相違点の構成に至る ような発明は、当業者にとっては通常格別な努力を必要とするものであ るから、容易には発明できないとして、進歩性が認められるべきである。
? 予測できない顕著な効果に関する判断の誤り 5 本願発明の有利な効果は、CRISPR/Caｓ9系が真核細胞において ゲノムDNAを切断することができたという点にあり、これ自体が本願第1 優先日当時の公知技術と比較して驚くべき効果であり、本願第1優先日当時 の技術水準の下で当業者が予測することができたものではない。そして、引 用文献1は、CRISPR/Caｓ9系が真核細胞において機能し得ること10 すら実証又は示唆するデータを開示しておらず、まして、CRISPR/C aｓ9系が真核細胞内で有利に標的特異性を有する可能性について示唆もし ていない。そのため、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞において成功裏 に用いることができたこと自体が、本願第 1 優先日当時の刊行物の記載及び 技術水準から予測可能なものではなく、本願発明の従来技術に勝る有利な効15 果である。本願発明は、治療剤の開発において新世界を開く効果があり、そ の技術的、商業的価値は多大なものである。現に、CRISPR/Caｓ9 系を用いてヒト細胞(真核細胞)のDNAを切ることができるという実験が 成功したときに世界が熱狂し、注目したことは周知の事実である。このよう に、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞系に適用することが可能であると20 示されたことによってゲノム編集技術への応用可能性が格段に広まり、CR ISPR/Caｓ9系は様々な場面で幅広く用いられることとなった。この こと自体が本願発明の顕著な作用効果として認定されるべきものである。そ の後のゲノム編集技術の発展をみても、本願発明は、画期的であり革新的な ブレイクスルー発明である。
25 2 被告 ? 相違点1の容易想到性の誤りの主張について 21 ア 真核細胞における標的DNAに適用する点について 阻害要因について 引用発明は、U型Caｓ9タンパク質と、天然では別個に存在するc ｒRNAとｔｒacｒRNAとを人工的に融合してなるキメラRNAと 5 を含む、人工物たるCaｓ9ポリペプチドを含む「プラスミド中の標的 DNAを緩衝液中で切断するための組成物」であって、 (原核細胞) 天然 のCaｓ9ポリペプチドをそのまま含むものではない。また、切断の対 象は、
「緩衝液中」に存在する「プラスミド(環状二本鎖DNA)中の標 的DNA」である。そうすると、引用発明は天然の原核細胞と関係はな10 く、原告が主張する真核細胞と原核細胞の相違は、そもそも、引用発明 を真核細胞に適用することの阻害要因たり得ない。
そして、原告が阻害要因として指摘する点は、当業者の誰もが求める 真核細胞における優れたゲノム編集ツールを、開発を試みることもなく これを断念させるようなものではない。実際のところ、本願発明の発明15 特定事項には、原告が阻害要因として指摘する点を回避するための創意 工夫は含まれていないし、実施例をみても、原告が阻害要因として指摘 する点に着目してそれを回避するための検討を行っていたことをうかが わせる記載は見いだせない。
a 阻害要因1について20 本件審決が認定した引用発明は、 (a)U型Caｓ9タンパク質」 「 自体を含んでおり、これは、
「プラスミド中の標的DNAを緩衝液中で 切断するため」に、当然、正しく折り畳まれたものであるから、
「Ca ｓ9タンパク質」に関して、本願発明の「(@)核局在化シグナルを有 するCaｓ9ポリペプチド」と引用発明の「(a)U型Caｓ9タンパ25 ク質」との相違部分は、
「核局在化シグナル」を有しているか否かだけ である。したがって、原告が主張する阻害要因1は、相違点1とは関 22 係がないものであり、その主張は前提において誤りである。
また、仮に、阻害要因1が、本願発明のうち、 (@)Caｓ9ポリ 「 ペプチドおよび核局在化シグナルをコードする核酸」の場合について の主張であるとしても、次のとおり、その主張は失当である。
5 すなわち、分解等の懸念があるのであれば、核酸の導入量を増やす など、当業者は、実験条件の最適化を当然行う。しかも、本願第1優 先日までに、原核細胞に由来するタンパク質を真核細胞中で機能的に 発現させた例は枚挙するにいとまがない。古くは1996年に、原核 細胞(大腸菌)に由来し、DNAに作用するタンパク質であるRec10 Aを、本願発明と同様に、核局在化シグナルを付加した形で真核細胞 (植物細胞)内において発現したところ、核内に移行し、植物細胞ゲ ノムDNAに対して正常な機能を発揮したことが報告されている(乙 20の3094頁右欄20ないし33行目)。
本願発明も、真核細胞内でCaｓ9ポリペプチドを正常に発現し、
15 折り畳み、分解されないようにするための発明特定事項は含んでいな いし、実施例にも、Caｓ9ポリペプチドを正常に発現し、折り畳み、
分解されないようにするための創意工夫は何ら認められない。本願発 明は、Caｓ9ポリペプチドをRecAなどと同様に誰もが望む真核 細胞で発現させてみたところ、予想どおり、何らの問題もなく、正常20 に発現され、折り畳まれて、機能が発揮されたというだけのことであ る。
b 阻害要因2について 仮に、ガイドRNAがヌクレアーゼによって分解等される懸念があ るのであれば、ガイドRNAの導入量を増やすなど、当業者は、実験25 条件の最適化を当然行う。
本願発明も、真核細胞環境内でガイドRNAが分解されないように 23 するための発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、ガイドRN Aを分解から保護するための創意工夫は何ら認められない。本願発明 でも、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞に導入したところ、予想 どおり、ガイドRNAも含めて特段の問題もなく存在し得て、機能が 5 発揮されたというだけのことである。
c 阻害要因3について 当業者であれば、引用発明を真核細胞に適用することを想起しただ けで、自ずと常套手段である核局在化シグナルの付加を導き出し、こ れによりCaｓ9ポリペプチドがガイドRNAと複合体を形成するこ10 とを当然予測し得た。
本願発明も、Caｓ9ポリペプチドを核内へ移行させるための手段 として、核局在化シグナルを付加すること以外の発明特定事項は含ん でいないし、実施例にも、核局在化シグナル以外の創意工夫は何ら認 められない。本願発明でも、CRISPR/Caｓ9系に真核細胞の15 核内移行における常套手段を適用したところ、予想どおり、何らの問 題もなく核内に移行して機能を発揮したというだけのことである。
d 阻害要因4について 本願第1優先日当時、既に、クロマチンの存在にもかかわらず外来 タンパク質が真核細胞の核内のゲノムDNAに作用した数多の例が知20 られていた。例えば、CRISPR/Caｓ9系と同様に原核細胞に 由来するRecA(乙20)や、CRISPR/Caｓ9系と同様に ゲノム編集ツールとして周知のZFN(甲21、22、25、26、
乙7)やTALEN(甲23、24、30、乙7)である。
本願発明も、クロマチンの存在による悪影響を低減させるための発25 明特定事項は含んでいないし、実施例にも、クロマチンの存在による 悪影響を低減させるための創意工夫は何ら認められない。本願発明で 24 も、RecA、ZEN及びTALEN等の先例から予想されるとおり、
クロマチンによる悪影響はなかったというだけのことである。
e 阻害要因5について 本願第1優先日前に、既に、ZFN及びTALENで真核細胞ゲノ 5 ムにおける標的配列を切断することが広く知られていたところ(甲2 1ないし26) これらのゲノム編集ツールが、
、 サイズの大きなゲノム を対象とする場合に標的配列へのアクセスが不可能となったり、困難 を伴うとの事情があったとは認められない。また、各ゲノム編集ツー ルの標的配列の長さに着目すると、ZFNは、18ないし36塩基対、
10 TALENは、24ないし40塩基対であって(甲90)、いずれも、
真核細胞ゲノム中でこのような長さの標的配列にアクセスし、切断す ることができていたものである。これに対して、CRISPR/Ca ｓ9系の標的配列の長さは、17ないし23塩基対程度であって(甲 20の820頁図5A、甲90) ZFNやTALENの標的塩基対と 、
15 同程度なのだから、当業者は、真核細胞ゲノムが大きいためにCRI SPR/Caｓ9系が標的配列を探し当てられないとか、アクセスで きないなどとは考えない。
本願発明も、サイズの大きな真核細胞ゲノム中の標的にアクセスす るための発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、真核細胞ゲノ20 ムの大きさを克服して標的にアクセスするための創意工夫は何ら認め られない。本願発明でも、ZFNやTALENの先例から予測される とおり、CRISPR/Caｓ9系が真核細胞ゲノム中の標的配列に アクセスしてその場で切断することができたというだけのことである。
f 阻害要因6について25 グループUイントロンシステムはCRISPR/Caｓ9系とは別 物であって、CRISPR/Caｓ9系と関連性の薄い事例にすぎな 25 い。
本願発明は、真核細胞中のマグネシウムイオン濃度に対応するため の発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、真核細胞中のマグネ シウムイオン濃度に対応するための創意工夫は何ら認められない。本 5 願発明は、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞中に移し たところ、そのまま機能し得たというだけのものにすぎない。
g 阻害要因7について オフターゲットDNA配列への結合可能性は、DNA結合ドメイン の特異性の程度に依存し、従来から使用されていたZFN及びTAL10 ENでも同様に留意される切断特異性の問題である。そして、オフタ ーゲット切断であれ、オンターゲット切断(本来の標的配列の切断) であれ、DNAが切断されても、細胞はDNA修復機構を有しており、
死滅するわけではないのだから、オフターゲット結合やオフターゲッ ト切断の懸念が、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用するこ15 とを妨げるはずはない。
本願発明は、CRISPR/Caｓ9系によって生じる可能性があ る細胞毒性を回避するための発明特定事項は含んでいないし、実施例 にも、そのための創意工夫は何ら認められない。本願発明は、引用発 明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞中に移したところ、そのま20 ま機能し得たというだけのものにすぎない。
本願第1優先日当時における当業者の認識及び技術常識について a 原告が前記1?ア aにて示した例(T7 RNAポリメラーゼ、
グループUイントロンシステム、リボスイッチ、リボザイム)は、い ずれもCRISPR/Caｓ9系とは関連性の薄い技術であって、引25 用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用することの強い 動機付けを阻害するほどの事情ではない。むしろ、真核細胞に由来し 26 ないシステムを真核細胞において機能させる試みが数多く存在すると いう事実は、真核細胞で機能させることが望まれるシステムはその由 来にかかわらず真核細胞に導入してみることが、当業者にとっていか に自然な発想であるかを如実に示している。
5 b 甲第48号証には、当業者がCRISPR/Caｓ9系をZFNや TALENに替わる真核細胞のゲノム編集ツールとして期待を寄せ、
実際に適用したことが示されており(甲48の1頁要約、Inｔｒｏdｕcｔi ｏn、訳文は乙21)、甲第49号証には、引用文献1の発行直後に当業 者がCRISPR/Caｓ9系の真核細胞への適用に取りかかってい10 たことが示されており(甲49の4頁左欄6行目ないし右欄4行目、
訳文は乙22) 甲第37号証には、
、 引用文献1に接した当業者が速や かに植物や動物といった真核細胞に適用したことが示されており(甲 37の2頁24ないし31行目、訳文は乙23)、甲第87号証には、
引用文献1のCRISPR/Caｓ9系が、引用文献1発行直後に真15 核細胞に適用されたことが紹介されており(甲87の1頁本文14な いし23行目、訳文は乙24)、甲第41号証には、CRISPR/C aｓ9系を真核細胞に適用することを強く推奨し、その成功が期待で きることが示されている(甲41の1658頁中欄10ないし14行 目、1660頁右欄5ないし6行目、同頁右欄26ないし30行目、
20 訳文は乙25)。
c 甲第41、第48及び第49号証は、引用文献1の影響力の大きさ を裏付けるとともに、数多くの当業者グループが、独立に、しかし、
まるで示し合わせたかのように、引用文献1の発行直後にCRISP R/Caｓ9系を真核細胞に適用し始めたことを示すものである。
25 ZFN及びTALENとCRISPR/Caｓ9ポリペプチドとの相 違について 27 引用発明は、本来的に原核細胞を対象とした技術ではなく、CRI SPR/Caｓ9系が天然の原核細胞で見いだされたことは、もはや 引用発明とは関係のないことなのだから、CRISPR/Caｓ9系 が原核細胞由来であることから真核細胞に適用することが困難とする 5 原告の主張は、前提において誤りがある。引用発明のCRISPR/ Caｓ9系のRNA成分である (b) 「 cｒRNAの3′末端側にｔｒ acｒRNAの5′末端側が融合したキメラRNA」 原告の主張にお ( いては「g(ガイド)RNA」 )は、自然界に存在するcｒRNAと 。
ｔｒacｒRNAとを人工的に融合して単純化したものであって、自10 然状態において原核細胞で生じるものではない。
しかも、それぞれのDNA結合ドメインを比べてみると、ZFNで は、1モジュールのタンパク質が3塩基の標的配列を認識して結合し、
TALENでは、1モジュールのタンパク質が1塩基の標的配列を認 識して結合し、CRISPR/Caｓ9系では、1塩基のRNAが115 塩基の標的配列を認識して結合するから(乙7の9頁図1) いずれの 、
DNA結合ドメインにしても、DNAという物質に直接作用して、き わめて機械的な機序で標的配列を認識して切断する活性を有するにす ぎない。そして、ZFNやTALENのDNA結合ドメインが、真核 細胞のクロマチン環境に特化した構造や標的配列認識機構を有してい20 るわけではないし、CRISPR/Caｓ9系のDNA結合ドメイン が原核細胞のDNAしか認識できないわけでもない。
また、CRISPR/Caｓ9系が標的配列に結合するに際して標 的DNAの二重らせん構造の開放を行うという点は、CRISPR/ Caｓ9系がDNA(二重らせん構造を有することは自明である。 の )25 標的配列に結合してその場でDNAを切断する以上は、引用文献1自 体に示されていることであり、引用発明の真核細胞への適用を妨げる 28 ことはない。
イ 核局在化シグナルの付加の点について 核局在化シグナルを付加することは、ポリペプチドを核に送達するた めの常套手段であって、引用発明を真核細胞に適用することを想起した 5 だけで自ずと導き出される常套手段にすぎない。実際、引用文献1の発 行からわずか数か月のうちに、数多の研究グループが、独立して、一斉 に、CRISPR/Caｓ9系を使って真核細胞のゲノム編集を行った ところ、それらの全てにおいて、例外なく、核局在化シグナルが付加さ れていたというのが、本願第1優先日当時の実情である。
10 細胞環境について 核局在化シグナルとは、細胞核の中で働くタンパク質が細胞質で合成 された後、核内にまで能動的かつ選択的に輸送されるために必要な数個 ないし十数個のアミノ酸からなる配列をいう(乙4) 真核細胞内におい 。
て、核局在化シグナルを有する物質は、核膜に存在する小さな核膜孔を、
15 シャッターのように直径約100nmに開いて、核内へと通過する(乙 29、30) また、
。 直径9nm程度(ガイドRNAは優にこれを下回る。) より小さな物質は、核局在化シグナルがなくとも、小さな核膜孔を自由 に通過する(乙30)。Caｓ9ポリペプチド(約163kDa)のよう なタンパク質の大きさは、せいぜい数nm程度である(乙31ないし320 3)から、核局在化シグナルを有してさえいれば、そのまま、直径約1 00nmに開口した核膜孔を通過して、核内へと移行する。
サイズの相違について 核局在化シグナルは、核内へ移行するための必要かつ十分な活性をも つものであって、それさえ有していれば、約170kDaのMTaｓe25 (DNAシトシン―5―メチルトランスフェラーゼ)(乙34)、約18 5kDaのトポU(DNAトポイソメラーゼU)(乙35)、約239k 29 DaのSen1ｐ(乙36)といった、Caｓ9ポリペプチド(約16 3kDa)を上回るサイズのタンパク質のみならず、桁違いに大きく複 雑な巨大複合体であるウイルス粒子でさえ、核膜孔を直径約100nm に開口して通過することが広く知られていた(乙37) 直径約100n 。
5 mに開口した核膜孔と比べて、数十ないし数百kDa程度のタンパク質 は十分小さく、その形状が核膜孔の通過しやすさに影響するとは到底考 えられない。
したがって、Caｓ9ポリペプチドのサイズや形状は、核局在化シグ ナルを付加することを妨げる理由にはならない。
10 「容易の容易」について 本件審決は、核局在化シグナルの付加は、引用発明のCRISPR/ Caｓ9系を真核細胞に適用することを想起しただけで、何らの創意工 夫もなく導き出される程度のことにすぎないとしたものであって、いわ ゆる「容易の容易」に当たらないことは、本件審決の文言上明らかであ15 る。
? 予測できない顕著な効果に関する判断の誤りについて 本願発明の効果は、CRISPR/Caｓ9系が真核細胞において標的D NAを切断することができたというものであるが、これは、まさに、引用発 明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用することを想起すると同時20 に当然想定される結果にすぎず、効果の顕著性など見いだす余地もない。
第4 当裁判所の判断 1 本願発明について 本願明細書には、別紙1「本願明細書の記載事項(抜粋)」のとおりの記載が あり、この記載によると、本願発明について、次のような開示があると認めら25 れる。
? 技術分野 30 本願発明は、真核細胞又は真核生物における標的化ゲノム編集に関するに 関するものである(【0001】 。
) ? 背景技術 CRISPR(クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復 5 配列、Clｕｓｔeｒed Regｕlaｒlｙ Inｔeｒｓｐaced Shｏｒｔ Palindｒｏmic Reｐeaｔ) は、配列決定された細菌の約40%及び配列決定された古細菌の90%のゲ ノムにおいて見出される多数の短い直列反復配列を含む遺伝子座であるが、
原核生物の免疫系として機能する 【0002】 。
( ) タイプUCRISPR/C aｓシステムに必須のタンパク質成分であるCaｓ9ポリペプチドは、CR10 ISPR RNA(cｒRNA)及びトランス活性化cｒRNA(ｔｒac ｒRNA)と呼ばれる2つのRNAと複合体を形成した場合、活性を有する エンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入したファージ又はプラスミ ド中の外来遺伝因子を切断して、宿主細胞を防御する(【0003】 。
) 近年、【A】ら(1)は、cｒRNA及びｔｒacｒRNAの必須部分の融15 合によって産生された一本鎖キメラRNAがCaｓ9/RNA複合体中の2 つのRNAと置き換え可能であり、機能的なエンドヌクレアーゼを形成でき ることを実証した(【0003】 。
) ヌクレオチド結合CRISPR-Caｓタンパク質における部位特異性は、
設計及び合成がより困難であり得るDNA結合タンパク質の代わりに、RN20 A分子に支配されているので、CRISPR/Caｓシステムは、ジンクフ ィンガー及び転写活性化因子様エフェクターDNA結合タンパク質に対して 利点を提供する(【0004】) ? 発明が解決しようとする課題 今まで、CRISPR/Caｓシステムに基づくRNA誘導型エンドヌク25 レアーゼ(RGEN)を用いたゲノム編集法は開発されていなかったところ、
本願発明は、CRISPR/Caｓシステムに基づくゲノム編集法であり、
31 真核細胞及び真核生物において標的化してDNAを切断するプログラム可能 なRNA誘導型エンドヌクレアーゼを開発したものである 【0004】 ( 、
【0 006】 。
) ? 課題を解決するための手段 5 本願発明の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNA若しくはガイドR NAをコードするDNA、及びCaｓタンパク質コード核酸若しくはCaｓ タンパク質を含有する、真核細胞又は真核生物中の標的DNAを切断するた めの組成物を提供することである(【0007】 。
) ? 発明の効果10 本願発明は、新しい便利なゲノム編集ツールを提供する(【0021】 。
) ? 発明を実施するための形態 ア 本願発明より前に、Caｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は知ら れていたが、真核生物のゲノムの複雑さのため、Caｓタンパク質のエン ドヌクレアーゼ活性が真核細胞中で機能するかどうかは知られていなか15 った(【0025】 。ZFN及びTALENと比較して、Caｓタンパク質 ) に基づく本願発明の組成物は、合成ガイドRNA成分が置き換えられるだ けで新たなゲノム編集ヌクレアーゼを作製できるため、より容易にカスタ ム化され得る上、オフターゲット作用を持たないため、望ましくない突然 変異、欠失、逆位、及び重複を引き起こさない特性を有することから、真20 核細胞及び真核生物におけるゲノム工学のための拡張性のある、汎用的で 便利なツールとなる(【0026】 。
) イ Caｓの遺伝子及びタンパク質に関する情報は、国立生物工学情報セン ター(Naｔiｏnal Cenｔeｒ fｏｒ Biｏｔechnｏlｏgｙ Infｏｒmaｔiｏn、NCBI)のG enBankから、制限なく利用できる(【0027】 。3種類のCRIS )25 PR-Caｓシステムが存在し、そのうち、Caｓ9タンパク質並びにc ｒRNA及びｔｒacｒRNAを含むタイプUCRISPR/Caｓシ 32 ステムが代表的であり、よく知られている(【0028】 。
) ウ 本願発明の組成物は、タンパク質の形態で、又はCaｓタンパク質をコ ードする核酸の形態で、Caｓ成分を含有しうるものであり、Caｓタン パク質は、ガイドRNAと複合体を形成した際、それがエンドヌクレアー 5 ゼ活性又はニッカーゼ活性を有する限り、任意のCaｓタンパク質であり 得る(【0029】 。
) エ 本願発明では、ガイドRNAは、CRISPR RNA(cｒRNA) 及びトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)で構成され、又はc ｒRNA及びｔｒacｒRNAの必須部分の融合によって作製される一10 本鎖RNA(ｓgRNA)やcｒRNA及びｔｒacｒRNAを含むデュ アルRNAであり得、ガイドRNAがcｒRNA及びｔｒacｒRNAの 必須部分並びに標的と相補的な部分を含むならば、任意のガイドRNAが 本願発明において使用され得る(【0033】 。
) オ ガイドRNAは、RNA又はガイドRNAをコードするDNA(核酸)15 の形態で、細胞又は生物に移入され得る(【0035】 。
) 2 取消事由(引用発明に基づく本願発明の進歩性判断の誤り)の有無について ? 相違点1の容易想到性判断の誤りの有無について ア 引用発明1について 引用文献1には、別紙2「引用文献1の記載事項(抜粋・訳文)」のとお20 りの記載があり(訳は、甲20添付訳文及び乙8による。 、@クラスター ) 化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復(CRISPR)/C RISPR関連(Caｓ)系を構成するｔｒacｒRNA及びcｒRNA に基づいて設計されたキメラRNAとU型Caｓ9タンパク質とにより、
プラスミド中の、キメラRNAと塩基対を形成する標的DNAが、緩衝液25 中で切断されることを実験により確認したこと、A当該キメラRNAが、
cｒRNAの3′末端側にｔｒacｒRNAの5′末端側を融合させた 33 ものであることが記載されており、これら記載によると、引用発明として、
本件審決が認定するとおりのものを認定することができ、この点は、当事 者間にも争いがない。
イ 相違点1について 5 本願発明の組成物と引用発明の組成物とを対比すると、相違点として、
本件審決が認定するとおりの相違点1及び2を認定することができ、こ の点は、当事者間にも争いがない。
ここで、原告は、相違点1を「本願発明は、
「真核細胞」における標的 DNAを切断するための組成物であるのに対して、引用発明は、
「緩衝液10 中」の標的DNAを切断するための組成物である点」以下 ( 「相違点1A」 という。 と ) 「本願発明は、Caｓ9ポリペプチドが「核局在化シグナル」 を有しているのに対して、引用発明は、Caｓ9ポリペプチドが「核局 在化シグナル」を有していない点」(以下「相違点1B」という。)とに 分けてその容易想到性を論じているから、当裁判所も、ひとまず便宜的15 にこれに従い、以下、判断を加える。
相違点1Aについて 引用文献1には、
「クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い 回文の反復(CRISPR)/CRISPR関連(Caｓ)系」のcｒ RNAとトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)が塩基対にな20 って形成されるデュアル-ｔｒacｒRNA:cｒRNAが、Caｓ9 ポリペプチドに標的DNAの二本鎖切断を指示することが記載され、そ の上で、
「このデュアル-ｔｒacｒRNA:cｒRNAは、一本鎖RN Aキメラとして設計されたときも、配列特異的に、Caｓ9による二本 鎖DNA切断を誘導する。私たちの研究は、部位特異的DNA切断のた25 めにデュアル-RNAを使用するエンドヌクレアーゼのファミリーを明 らかにし、RNAでプログラム可能なゲノム編集のためにこのシステム 34 を利用する可能性を強調する。」と記載されている(816頁要約)。そ して、引用文献1には、引用発明のCRISPR/Caｓ系に関して、
「ゲノム標的化及びゲノム編集のための・・・システムを開発すること ができるという刺激的な可能性を示している。 (816頁中欄35行目 」 5 ないし右欄3行目)及び「プログラムされたDNA切断及びゲノム編集 において潜在的に有用であるため、魅力的である。 (820頁左欄2な 」 いし5行目)とも記載されている。さらに、引用文献1には、
「ジンク- フィンガーヌクレアーゼや転写活性化様エフェクターヌクレアーゼは、
ゲノムを操作するために設計された人工酵素として、大きな関心を集め10 た。私たちは、遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大 きな潜在能力をもたらし得るRNAによりプログラムされたCaｓ9に 基づく代替的な手法を提案する。 (820頁右欄2ないし9行目)と記 」 載されている。
これらの記載からみて、引用文献1には、引用発明1のCRISPR15 /Caｓ9系がゲノム編集に有用であろうことが示唆されており、CR ISPR/Caｓ9系はゲノムを操作するために設計された人工酵素で あるZFNやTALENに替わり得る新たなゲノム編集の手段として提 案されていたと認められる。
一方、本願第1優先日当時、ゲノム編集の主たる対象は真核細胞であ20 って、ZFNやTALENが真核細胞中の標的DNAすなわち核内のゲ ノムを切断するものであることは技術常識である(甲21の1464頁 34ないし36行目、甲22の339頁右欄15行目ないし340頁左 欄16行目、甲23の143頁右欄8ないし13行目、甲24の2頁右 欄35ないし40行目、甲25の1[0064]〔訳は甲25の2【0025 64】による。 、甲26の1[CLAIM 3][0075]ないし[007 〕 、
8] 〔訳は甲26の2【請求項3】【0075】ないし【0078】によ 、
35 る。) 〕。
また、本願第1優先日当時、タンパク質や核酸を真核細胞へ送達する 各種手段は周知技術である(甲25の1[0068] 〔訳は甲25の2【0 068】による。 、甲26の1[0075]、[0104]、[0105]〔訳 〕 5 は甲26の2【0075】 【0104】 【0105】による。 ) 、 、 〕。
これらの点を踏まえれば、引用文献1の記載に接した当業者は、引用 文献1にいう「ゲノム編集」は「真核細胞」におけるゲノム編集をも意 図するものと認識し、本願第1優先日当時の周知技術に基づいて、引用 発明のCRISPR/Caｓ9系を、真核細胞のゲノム上の標的DNA10 の切断に用いようと試みるものといえる。
相違点1Bについて 真核細胞のゲノムが核内に存在することは当業者にとって自明の事項 であるところ、タンパク質を真核細胞の核内に移行させるために核局在 化シグナルを付加することは、本願第1優先日当時の常套手段である(甲15 24の2頁図1、甲25の1[0039]〔訳は甲25の2【0039】 による。 、
〕 甲26の1[0085] 訳は甲26の2 〔 【0085】による。 、
〕 甲27の23頁27行目ないし24頁6行目、甲28【請求項1】、甲2 9【0147】 。
) そうすると、上記 のとおりに引用発明のCRISPR/Caｓ9系20 を真核細胞のゲノム上の標的DNAの切断に用いようと試みる当業者は、
Caｓ9ポリペプチドに核局在化シグナルを付与することを常套手段と して当然に行うと認められるから、核局在化シグナルの付与に独自の創 意工夫を挟ませる余地はないといえる。
小括25 以上からすると、相違点1は容易に想到できるといえる。
ウ 原告の主張について 36 原告は、前記第3の1?アのとおり、引用発明を真核細胞へ適用する際 の阻害要因(同 )、本願第1優先日当時の当業者の認識及び技術常識(同 ) 又は引用発明とZFN及びTALENといった従来技術との相違 、 (同 )から、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞の核内のゲノ 5 ムに対して機能させようと試みることは動機付けられない旨主張する。
本願発明と引用発明とは、引用発明のCaｓ9ポリペプチドが「核局在 化シグナル」を有していない点(相違点1B)を除き、@物としての構成、
すなわち、
(@)Caｓ9ポリペプチドと(A)cｒRNA配列がｔｒac ｒRNA配列に対して5′末端側に融合し、標的DNAにハイブリダイズ10 するガイドRNAを含むキメラガイドRNAを含む組成物であるという 点で一致し、A用途としての構成、すなわち、標的DNAを切断するため のCRISPR/Caｓ9系である点で一致する。そして、真核細胞に適 用するための単なる常套手段である上記相違点1B以外、本願発明が真核 細胞における標的DNAを切断するための組成物である点(相違点1A)15 に関して、そのような用途に用いるについて本願発明が特徴的な構成を有 することは原告から何も主張されておらず、実際、本願発明の構成から、
引用発明の構成に加えて、そのような特徴的な構成のための限定あるいは 付加をうかがうことはできない。そうすると、本願発明の構成を前提とす る限り、本願発明は、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を常套手段を用20 いて真核細胞に適用できることを確認したにすぎないものである。
したがって、なおも本願発明の構成を前提としてこれが容易想到である とはいえないというためには、本願発明が真核細胞における標的DNAを 切断するための組成物である点(相違点1A)について、引用発明のCR ISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用しようと試みることは動機付け25 られないとする特別な事情が必要である。
以下、このような観点から、原告において本願発明が容易に想到できる 37 とはいえないことを基礎付けると主張する阻害要因等について検討する。
阻害要因について 原告は、前記第3の1?アのとおり、本願第1優先日当時の当業者の 認識として、@Caｓ9ポリペプチドのように真核細胞内に本来的に存 5 在しないタンパク質は、真核細胞内では、不適切なフォールディングに より活性を失うか、ユビキチン経路と呼ばれる真核細胞に存在するタン パク質分解経路によって認識されて分解されることが想定された(阻害 要因1) AガイドRNAがCaｓ9ポリペプチドと複合体を形成するよ 、
りも前に真核細胞性のヌクレアーゼによって分解されたり、分子シャペ10 ロンがガイドRNAに結合して機能性CRISPR/Caｓ9系が形成 されるのが邪魔されることが想定された(阻害要因2) BCaｓ9ポリ 、
ペプチドが、真核細胞の細胞質から核へと移動し、次いでガイドRNA を見つけ出しそれと機能可能な正しい複合体を形成することができない ことが想定された(阻害要因3) C真核細胞のゲノムDNAが高度に折 、
15 り畳まれているクロマチンによってCRISPR/Caｓ9系の使用が 阻まれることが想定された(阻害要因4) DCRISPR/Caｓ9系 、
がゲノムサイズの大きな真核細胞ゲノムについて標的配列ではないDN A配列を切断してしまうことが想定された(阻害要因5) E低濃度のマ 、
グネシウムイオン環境である真核細胞においては、CRISPR/Ca20 ｓ9複合体を適用してDNAを切断することはできないことが想定され た(阻害要因6) FガイドRNAを真核細胞に導入することに伴う細胞 、
毒性があることが想定された(阻害要因7)ことが阻害要因となる旨、
るる主張する。
しかしながら、原告の上記主張は、原核細胞と真核細胞の相違から、
25 引用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用する際に生じ得 る事象の一般的・抽象的な可能性又は懸念を述べるにとどまるものであ 38 って、具体的にこれら事象が生じることが確認されていたことを示すも のではないから、引用発明を真核細胞に適用するに際する障害として、
引用発明の構成から具体的に克服しなければならない課題を述べるもの とはいえない。
5 したがって、上記のような一般的 抽象的な可能性又は懸念をもって、
・ 引用発明のCRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用しようと試みる ことが動機付けられない特別の事情に当たるとはいえず、むしろ、前記 イ のとおり、引用文献1に接した当業者は、当然に、CRISPR/C aｓ9系を真核細胞に適用しようと試みるものといえる。
10 したがって、原告主張の上記各阻害事由は、本件結論を左右し得るも のではない。
当業者の認識及び技術常識について 原告は、前記第3の1?ア aないしcのとおり、@本願第1優先日 当時、T7 RNAポリメラーゼ、グループUイントロンシステム、リ15 ボスイッチ、リボザイムのように真核細胞由来ではないシステム及び遺 伝子を真核細胞において機能させる数々の試みが失敗してきた、A当業 者はCRISPR/Caｓ9系が真核細胞内で機能し得ることについて は専ら否定的な見解を有していた旨主張する。
しかしながら、原告の指摘内容からしても、T7 RNAポリメラー20 ゼ、グループUイントロンシステム、リボスイッチ、リボザイムは、真 核細胞由来ではないシステムという限度でCRISPR/Caｓ9系と 関連するのにとどまり、CRISPR/Caｓ9系とは関連性の薄い技 術に関するものにすぎず、少なくとも、T7 RNAポリメラーゼ等の 前記技術を真核細胞に適用することに失敗した例を報告する論文があっ25 たとしても、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用することを試 みることを妨げるものとはいえない。
39 また、本願第1優先日当時の当業者の認識等について、原告は、前記 第3の1?ア bのとおり、本願第1優先日前後に刊行された各文献に、
CRISPR/Caｓ9系が真核細胞内で機能し得ることについて否定 的な記載がある旨主張するが、これらの記載は、真核細胞への適用に当 5 たり解決すべき課題として当業者が認識していたものを具体的に明らか にするものではない。かえってこれらの文献には、
「真核細胞において部 位特異的DNA切断をするための代替手段は、非常に興味深い。 (甲4 」 8の1頁Inｔｒｏdｕcｔiｏn6ないし8行目、訳は乙21による。 、
) 【D】 「 は、
『私の研究室は、どのようにすればCRISPR/Caｓ9が真核細胞10 において適切に機能するかについて探索を始めた』と述べた。『その間、
ハーバード大学の【E】やMITの【F】の研究グループもまた、CR ISPR/Caｓ9が真核細胞において機能し得るかを確認するため、
懸命に作業を行っていた』 」 。 (甲49の20頁左欄13ないし17行目。
訳は乙22による。 、単一のプログラム可能なRNA鎖のみを必要とす )「15 るようにシステムを設計できるとしたらどうだろうか。そうすると、生 物学者はそれを使用して任意のDNA配列を簡単に標的化して切断する ことができる。
【D】は『興奮の寒気』を感じた。(甲37の2頁26な 」 いし28行目。訳は乙23による。 、
)「先週サイエンス誌速報に発表され た2つの新しい論文は、この技術がヒト細胞でも作用することを示した。
20 ヒト細胞での同様の成功を報告する【D】らの論文は新しいオープンア クセスなeLife誌で発行されることが受理された。 (甲87の1頁 」 20ないし23行目。訳は乙24による。 、【A】らによる新しい研究 )「 は、特定のゲノム配列を標的とすることができる試薬の設計のための、
新しいアプローチ―最も原始的なDNA認識に基づく―を提供した」甲 (25 41の1658頁中欄10ないし14行目。訳は乙25による。 、
)「この システムを真核細胞に適用する試みだけが、これらの懸念を払拭するで 40 あろう。 甲41の1660頁右欄5ないし6行目。
」 ( 訳は乙25による。 、
) 「CRISPRシステムが、標的切断手法の次の次の世代を提供するか どうかはまだわからないが、試す価値があることは明らかである。乞う ご期待。 (甲41の1660頁右欄26ないし30行目。訳は乙25に 」 5 よる。)とあるように、当業者は、原核細胞と真核細胞の違いを認識しつ つも、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞に適用することを試みる価 値のある有望なものと認識していたものであって、実際に、本願第1優 先日当時、複数の研究機関がその適用を試みており(甲35、36、4 8、49、乙15)、むしろ、CRISPR/Caｓ9系の真核細胞への10 適用を試みることには当業者にとって何ら障害のあるものではなかった というべきである。
以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。
ZFN及びTALENとCRISPR/Caｓ9系との相違について 原告は、前記第3の1?ア のとおり、ZFNやTALENはCRI15 SPR/Caｓ9系のようにRNAと複合体を形成するような構造では ないことから、ZFNやTALENといった従来技術の活用例から、C RISPR/Caｓ9系を真核細胞へと適用することの動機付けを見い だすことはできない旨主張する。
しかしながら、原告の指摘内容にあるとおり、ZFNは、真核細胞の20 ゲノムDNA配列に結合するジンクフィンガーモジュールと細菌由来の ゲノムDNA配列を切断する機能を有するFｏk1酵素とからなり、T ALENは、真核細胞である植物細胞のゲノムDNA配列に結合するT ALエフェクターと上記Fｏk1を組み合わせたものであり、真核細胞 由来以外の要素も含むものであるから、CRISPR/Caｓ9系が原25 核細胞由来のものであるというだけで、当業者がCRISPR/Caｓ 9系を真核細胞に適用することの試みさえ躊躇するものとはいい難い。
41 また、ZFNやTALENのDNA結合ドメインが、真核細胞のクロマ チン環境に特化した構造や標的配列認識機構を有しているとの事情も見 いだせない。そうしてみると、ZFNやTALENと、CRISPR/ Caｓ9系との構造等の違いをもって、CRISPR/Caｓ9系を真 5 核細胞における標的DNAの切断に適用することが動機付けられないと はいえない。
以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。
核局在化シグナルの付加の点について 原告は、前記第3の1?イのとおり、@ZFNやTALENよりもサ10 イズが大きく構造も異なるCRISPR/Caｓ9系が真核細胞の核膜 を通過して核内へと移行することは想到できない、A核局在化シグナル を利用してポリペプチドを真核生物の核内に移行させられ得るとしても、
核内に移行したCaｓ9ポリペプチドがガイドRNAと複合体を形成で きるか予測できない、B引用発明の対象を真核細胞へと変更し、さらに、
15 核内移行手段として核局在化シグナルを用いることは、いわゆる2ステ ップを要する「容易の容易」であるから、容易想到とはいえない旨主張 する。
しかしながら、核局在化シグナルを有する物質が核膜に存在する小さ な核膜孔を直径約100nmに開いて核内へと通過することは、本願第20 1優先日当時の技術常識であり(乙29) 約170kDaのMTaｓe 、
(DNAシトシン―5―メチルトランスフェラーゼ)(乙34)、約18 5kDaのトポU(DNAトポイソメラーゼU)(乙35)、約239k DaのSen1ｐ(乙36)といった天然の核局在化シグナルを有する タンパク質が核膜孔を直径約100nmに開口して通過することが広く25 知られていたから、163kDa程度の分子量であるCaｓ9ポリペプ チドについて、核局在化シグナルを付加するという常套手段を採用する 42 ことによって核内に移行させ得ることを十分に期待できたといえ、CR ISPR/Caｓ9系がZFNやTALENよりもサイズが大きく構造 も異なる点は、CRISPR/Caｓ9系を真核細胞へ適用することの 試みを何ら妨げない。そして、Caｓ9ポリペプチドが核内に移行して 5 ガイドRNAと複合体を形成できるか予測できないと主張する点は、前 記第3の2?ア cの阻害要因3と同趣旨の主張であるから、前記 の とおり、単にCRISPR/Caｓ系を真核細胞に適用する際に生じる 事象の一般的 抽象的な可能性又は懸念を述べるにとどまるものである。
・ そして、核局在化シグナルはタンパク質を真核細胞の核内に移行させ10 るための常套手段であるから、引用発明のCRISPR/Caｓ9系を 真核細胞に適用しようとすること、すなわち、Caｓ9ポリペプチドを 真核細胞の核内に移行しようとするならば、真核細胞の核内に移行する 手段を採用するのは至極当然のことであり、Caｓ9ポリペプチドへの 核局在化シグナルの付加は、引用発明のCRISPR/Caｓ系を真核15 細胞へ適用しようと試みると同時に当然導き出されることである。そう すると、核局在化シグナルの付加は、真核細胞に適用されたCRISP R/Caｓ9系との構成を前提にしてこれに対して更に改変を加えると いうものではなく、いわゆる「容易の容易」に当たるようなものではな い。
20 以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。
そのほか原告がるる主張するところも、前記イの判断を左右するもの ではない。
? 予測できない顕著な効果について 原告は、前記第3の1?のとおり、本願発明には、真核細胞内のゲノムD25 NAを切断し、編集することができるという予測できない顕著な効果がある 旨主張する。
43 しかしながら、発明の効果が予測できない顕著なものであるかについては、
当該発明の特許要件判断の基準日当時、当該発明の構成が奏するものとして 当業者が予測することのできなかったものか否か、当該構成から当業者が予 測することのできた範囲の効果を超える顕著なものであるか否かという観点 5 から検討する必要がある(最高裁判所平成30年(行ヒ)第69号令和元年 8月27日第三小法廷判決・集民262号51頁参照)。そして、本願発明の 構成は、真核細胞における標的DNAを切断するための組成物であるから、
そのような組成物が真核細胞内のゲノムDNAを切断し、編集することがで きるのは当然に予想されるといい得るところ、原告が予測できない顕著な効10 果として主張するものは、いずれも、真核細胞における標的DNAを切断す るための組成物であれば当然に備えることが予想される範囲内の効果をいう にすぎないから、本願発明に予測できない顕著な効果を認める余地はない。
? まとめ 以上のとおりであるから、相違点1の構成は容易に想到することができ、
15 そして、原告は、相違点2の構成が容易に想到できるとする本件審決の判断 を争うものではなく、さらに、本願発明は予測できない顕著な効果を奏する ものでもないから、本願発明は容易に発明することができたものである。
3 結論 よって、取消事由は理由がないから、原告の請求を棄却することとして、主20 文のとおり判決する。
追加
2544 裁判長裁判官5菅野雅之裁判官10本吉弘行裁判官15中村恭45 (別紙1)本願明細書の記載事項(抜粋)【発明の詳細な説明】5【技術分野】【0001】本発明は、真核細胞または真核生物における標的化ゲノム編集に関する。より詳細には、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCaｓタンパク質コード核酸もしくはCaｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的10DNAを切断するための組成物、ならびにその使用に関する。
【背景技術】【0002】CRISPR(クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列、
ClｕｓｔeｒedRegｕlaｒlｙInｔeｒｓｐacedShｏｒｔPalindｒｏmicReｐeaｔ)は、配列決定15された細菌の約40%および配列決定された古細菌の90%のゲノムにおいて見出される多数の短い直列反復配列を含む遺伝子座である。CRISPRは、原核生物の免疫系として機能し、そこでそれは、プラスミドおよびファージなどの外因性の遺伝因子に対する抵抗性を与える。CRISPRシステムは、一種の獲得免疫をもたらす。スペーサーと呼ばれる外来DNAの短いセグメントは、ゲノムのCRIS20PRリピートの間に組み込まれ、過去の曝露の記憶として機能する。CRISPRスペーサーは、その後、真核生物におけるRNAiと類似した方法で外因性遺伝因子を認識してサイレンシングするために用いられる。
【0003】タイプUCRISPR/Caｓシステムに必須のタンパク質成分であるCaｓ925は、CRISPRRNA(cｒRNA)およびトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)と呼ばれる2つのRNAと複合体を形成した場合、活性を有するエ46 ンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断して、宿主細胞を防御する。cｒRNAは、以前にこのような外来侵入物から捕捉された、宿主ゲノム内のCRISPRエレメントから転写される。近年、Jinekら(1)は、cｒRNAおよびｔｒacｒRNAの必須部分5の融合によって産生された一本鎖キメラRNAがCaｓ9/RNA複合体中の2つのRNAと置き換え可能であり、機能的なエンドヌクレアーゼを形成できることを実証した。
【0004】ヌクレオチド結合CRISPR-Caｓタンパク質における部位特異性は、設計10および合成がより困難であり得るDNA結合タンパク質の代わりに、RNA分子に支配されているので、CRISPR/Caｓシステムは、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクターDNA結合タンパク質に対して利点を提供する。
しかし、今まで、CRISPR/Caｓシステムに基づくRNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)を用いたゲノム編集法は、開発されていなかった。
15一方、制限酵素断片長多型(RFLP)は、分子生物学および遺伝学においていまだに広く使用されている、最も古く、最も簡便で、最も安価な遺伝子型決定法の1つであるが、制限エンドヌクレアーゼによって認識される適切な部位の欠如によってしばしば制限される。
【0005】20人工(Engineeｒed)ヌクレアーゼ誘発性突然変異は、様々な方法によって検出され、それらは、ミスマッチ感受性のT7エンドヌクレアーゼI(T7E1)アッセイまたはSｕｒｖeｙｏｒヌクレアーゼアッセイ、RFLP、蛍光PCR産物のキャピラリー電気泳動法、ジデオキシ配列決定法、およびディープシークエンシング(deeｐｓeｑｕencing)を含む。T7E1およびSｕｒ25ｖeｙｏｒアッセイは広く用いられるが、煩雑である。更に、突然変異配列が互いとホモ二本鎖を形成する可能性があり、ホモ接合性の二対立遺伝子突然変異体クロ47 ーンと野生型細胞とを区別できないため、これらの酵素は突然変異頻度を過小評価する傾向がある。RFLPはこれらの制約がないため、好まれる方法である。実際、
RFLPは、細胞および動物において人工ヌクレアーゼ仲介性突然変異を検出するための最初の方法の1つであった。しかし残念なことに、RFLPは適切な制限酵5素認識部位の利用可能性によって制限される。目的とする標的部位で利用できる制限酵素認識部位がない可能性がある。
【発明の概要】【発明が解決しようとする課題】【0006】10今まで、CRISPR/Caｓシステムに基づくRNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)を用いたゲノム編集法および遺伝子型決定法は、開発されていなかった。
このような状況下において、本発明者らは、多くの努力を払って、CRISPR/Caｓシステムに基づくゲノム編集法を開発し、ついに真核細胞および真核生物15において標的化してDNAを切断するプログラム可能なRNA誘導型エンドヌクレアーゼを確立した。
加えて、本発明者らは、多くの努力を払って、RFLP分析におけるRNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)の新規使用方法を開発した。本発明者らは、RGENを用いて、癌において見出される反復突然変異ならびにRGEN自身を含む20人工ヌクレアーゼによって細胞および生物に誘発された突然変異の遺伝子型決定を行い、それによって本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】【0007】本発明の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコ25ードするDNA、およびCaｓタンパク質コード核酸もしくはCaｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供48 することである。
本発明の他の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCaｓタンパク質コード核酸もしくはCaｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するた5めの組成物を提供することである。
【発明の効果】【0021】真核細胞または真核生物において標的DNAを切断するための、または標的化突然変異生成を誘発するための、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCaｓタ10ンパク質コード核酸もしくはCaｓタンパク質を含有する本組成物、本組成物を含むキット、ならびに標的化突然変異生成を誘発する方法は、新しい便利なゲノム編集ツールを提供する。加えて、カスタムRGENは任意のDNA配列を標的とするように設計することができるため、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入/欠失(indel)は、RGEN仲介性RFLPによって分析でき、従って、本発15明の組成物および方法は、自然発生多型および突然変異の検出および切断に使用されうる。
【図面の簡単な説明】【0022】【図1a】図1は、inｖiｔｒｏでのプラスミドDNAのCaｓ9触媒性切断20を示す。
(a)標的DNAおよびキメラRNA配列の模式図。赤い三角形は切断部位を示す。Caｓ9によって認識されるPAM配列は太字で示される。cｒRNAおよびｔｒacｒRNAに由来するガイドRNA中の配列は、それぞれ、囲み内および下線で示される。
【図1b】図1は、inｖiｔｒｏでのプラスミドDNAのCaｓ9触媒性切断25を示す。
(b)Caｓ9によるプラスミドDNAのinｖiｔｒｏでの切断。完全な(inｔacｔ)環状プラスミドまたはAｐaLI消化プラスミドを、Caｓ949 およびガイドRNAとともにインキュベートした。
【図3a】図3は、内在性の染色体部位でのRGEN誘発性突然変異を示す。(a)CCR5遺伝子座。
(上)T7E1アッセイを用いて、RGEN誘発性突然変異を検出した。矢印は、T7E1によって切断されるDNAバンドの予測される位置を示5す。突然変異頻度(Indelｓ(%)は、
)バンド強度の測定によって計算された。
(下)CCR5およびC4BPBの野生型(WT)ならびに突然変異体クローンのDNA配列。ガイドRNAに相補的な標的配列の領域は、囲み(bｏc)で示される。PAM配列は太字で示される。三角形は切断部位を示す。マイクロホモロジーに相当する塩基には下線が引かれている。右側の列は、挿入または欠失した塩基数10を示す。
【図10a】図10は、Caｓ9タンパク質/ｓgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。
【発明を実施するための形態】【0023】15本発明の1つの態様に従って、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCaｓタンパク質コード核酸もしくはCaｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供する。加えて、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCaｓタンパク質コード核20酸もしくはCaｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物の使用を提供する。
本発明では、組成物はまた、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)組成物とも呼ばれる。
【0024】25ZFNおよびTALENは、哺乳類細胞、モデル生物、植物、および家畜類において標的化突然変異生成を可能にするが、個々のヌクレアーゼによって得られる突50 然変異頻度は、それぞれ大きく異なる。更に、いくつかのZFNおよびTALENは、ゲノム編集活性を示すことができない。DNAのメチル化は、これらの人工ヌクレアーゼの標的部位への結合を制限しうる。
加えて、カスタム化ヌクレアーゼを作製することは、技術的に困難であり、時間が5かかる。
本発明者らは、Caｓタンパク質に基づく新たなRNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を開発することによって、ZFNおよびTALENの欠点を克服した。
【0025】本発明より前に、Caｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は知られていた。
10しかし、真核生物のゲノムの複雑さのため、Caｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が真核細胞中で機能するかどうかは知られていなかった。更に、これまで、
Caｓタンパク質またはCaｓタンパク質コード核酸および標的DNAに特異的なガイドRNAを含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物は、開発されていなかった。
15【0026】ZFNおよびTALENと比較して、Caｓタンパク質に基づく本RGEN組成物は、合成ガイドRNA成分が置き換えられるだけで新たなゲノム編集ヌクレアーゼを作製できるため、より容易にカスタム化され得る。サブクローニングステップは、カスタム化RNA誘導型エンドヌクレアーゼの作製に含まれない。更に、一対20のTALEN遺伝子(〜6kbｐ)と比較して、比較的小さいサイズのCaｓ遺伝子(例えば、Caｓ9では4.2kbｐ)は、ウイルス媒介性遺伝子送達などのいくつかの適用において、このRNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物に利点をもたらす。更に、このRNA誘導型エンドヌクレアーゼは、オフターゲット作用を持たないため、望ましくない突然変異、欠失、逆位、および重複を引き起こさない。こ25れらの特性は、本RNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を、真核細胞および真核生物におけるゲノム工学のための拡張性のある、汎用的で便利なツールにする。加51 えて、RGENは、任意のDNA配列を標的とするように設計することができ、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入/欠失(indel)が、RGEN仲介性RFLPによって分析され得る。RGENの特異性は、最大20塩基対(bｐ)までの長さの標的DNA配列とハイブリダイズするRNA成分およびプロトスペーサ5ー隣接モチーフ(PAM)を認識するCaｓ9タンパク質によって決定される。RGENは、RNA成分を置き換えることによって容易に再プログラム化される。従って、RGENは、様々な配列変異に対して簡単で確実なRFLP分析を使用するための基盤をもたらす。
【0027】10標的DNAは、内在性DNA、または人工DNA、好ましくは内在性DNAでありうる。
本明細書において用いられる場合、
「Caｓタンパク質」という用語は、CRISPR/Caｓシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、CRISPRRNA(cｒRNA)およびトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)と呼ばれ15る2つのRNAと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼを形成する。
Caｓの遺伝子およびタンパク質に関する情報は、国立生物工学情報センター(NaｔiｏnalCenｔeｒfｏｒBiｏｔechnｏlｏgｙInfｏｒmaｔiｏn、NCBI)のGenBankから、制限なく利用できる。
20【0028】Caｓタンパク質をコードするCRISPR関連(caｓ)遺伝子はしばしば、
CRISPRリピート-スペーサーアレイに関連付けられる。40を超える異なるCaｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Caｓ1は、様々なCRISPR/Caｓシステムに共通して遍在している25と思われる。3種類のCRISPR-Caｓシステムが存在する。それらのうち、
Caｓ9タンパク質ならびにcｒRNAおよびｔｒacｒRNAを含むタイプUC52 RISPR/Caｓシステムは、代表的であり、よく知られている。caｓ遺伝子とリピート構造の特定の組合せを用いて、8つのCRISPRサブタイプが定義されている(Ecｏli、Yｐeｓｔ、Nmeni、Dｖｕlg、Tneaｐ、Hmaｒi、Aｐeｒn、およびMｔｕbe)。
【0029】5Caｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインに結合されうる。タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはHIVに由来するTATタンパク質でありうるが、それに限定されない。
本組成物は、タンパク質の形態で、またはCaｓタンパク質をコードする核酸の形態で、Caｓ成分を含有しうる。
10本発明では、Caｓタンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成した際、それがエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を有する限り、任意のCaｓタンパク質でありうる。
好ましくは、Caｓタンパク質は、Caｓ9タンパク質またはその変異型である。
Caｓ9タンパク質の変異型は、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意の15アミノ酸に変更されたCaｓ9の突然変異型でありうる。好ましくは、他のアミノ酸はアラニンでありうるが、それに限定されない。
【0030】更に、Caｓタンパク質は、ストレプトコッカス属菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｓｐ.)、好ましくは化膿性連鎖球菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｐｙｏgenｓ)などの生物から単離されたも20の、または組換えタンパク質でありうるが、それらに限定されない。
化膿性連鎖球菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｐｙｏgenｓ)に由来するCaｓタンパク質は、
NGGトリヌクレオチドを認識しうる。Caｓタンパク質は、配列番号109のアミノ酸配列を含みうるが、それに限定されない。
【0031】25「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もし53 くはタンパク質の導入によって、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換えCaｓタンパク質は、ヒトコドン表を用いてCaｓタンパク質コード配列を再構成することによって生成されうる。
5【0032】本発明において、Caｓタンパク質コード核酸は、CMVまたはCAGなどのプロモーターの制御下にCaｓコード配列を含むプラスミドなどのベクターの形態でありうる。Caｓタンパク質がCaｓ9である場合、Caｓ9コード配列は、ストレプトコッカス属菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｓｐ.)に由来し、好ましくは化膿性連鎖球菌10(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｐｙｏgenｓ)に由来しうる。例えば、Caｓ9コード核酸は、配列番号1のヌクレオチド配列を含みうる。更に、Caｓ9コード核酸は、配列番号1の配列に少なくとも50%、好ましくは配列番号1に少なくとも60、70、80、90、95、97、98、または99%の相同性を有するヌクレオチド配列を含みうるが、それに限定されない。Caｓ9コード核酸は、配列番号108、11150、106、または107のヌクレオチド配列を含みうる。
【0033】本明細書において用いられる場合、
「ガイドRNA」という用語は、標的DNAに特異的であり、Caｓタンパク質と複合体を形成して、Caｓタンパク質を標的DNAに持ってくることができるRNAを指す。
20本発明では、ガイドRNAは、2つのRNA、すなわち、CRISPRRNA(cｒRNA)およびトランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)で構成され、
またはcｒRNAおよびｔｒacｒRNAの必須部分の融合によって作製される一本鎖RNA(ｓgRNA)でありうる。
ガイドRNAは、cｒRNAおよびｔｒacｒRNAを含むデュアルRNAであ25りうる。
ガイドRNAがcｒRNAおよびｔｒacｒRNAの必須部分ならびに標的と相54 補的な部分を含むならば、任意のガイドRNAが本発明において使用されうる。
【0034】cｒRNAは、標的DNAにハイブリダイズしうる。
RGENは、Caｓタンパク質およびデュアルRNA(不変のｔｒacｒRNA5および標的特異的cｒRNA)、またはCaｓタンパク質およびｓgRNA(不変のｔｒacｒRNAおよび標的特異的cｒRNAの必須部分の融合)で構成され、
cｒRNAの置き換えによって容易に再プログラム化されうる。
ガイドRNAは、更に、一本鎖ガイドRNAまたはデュアルRNAのcｒRNAの5′末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む。
10好ましくは、ガイドRNAは、更に、一本鎖ガイドRNAまたはデュアルRNAのcｒRNAの5′末端に2つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む。
【0035】ガイドRNAは、RNAまたはガイドRNAをコードするDNAの形態で、細胞または生物に移入されうる。ガイドRNAは、単離されたRNA、ウイルスベクタ15ー内に組み込まれたRNAの形であってもよく、またはベクターにコードされる。
好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターでありうるが、それらに限定されない。
ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターでありうる。例えば、ガイドRNAは、単離されたガイドRNA、もしくはガ20イドRNAおよびプロモーターをコードする配列を含むプラスミドDNAを細胞または生物にトランスフェクトすることによって、細胞または生物に移入されうる。
あるいは、ガイドRNAは、ウイルス媒介性遺伝子送達を用いて、細胞または生物に移入されうる。
【0036】25ガイドRNAが単離RNAの形態で細胞または生物にトランスフェクトされる場合、ガイドRNAは、当技術分野において既知の任意のinｖiｔｒｏ転写系を55 用いたinｖiｔｒｏでの転写によって調製されうる。ガイドRNAは、好ましくは、ガイドRNAのコード配列を含むプラスミドの形態よりもむしろ、単離RNAの形態で細胞に移入される。本明細書において用いられる場合、
「単離RNA」という用語は、
「裸のRNA」と置き換え可能でありうる。これは、クローニングのス5テップを必要としないため、コストと時間の節約になる。しかし、ガイドRNAのトランスフェクションのためのプラスミドDNAの使用またはウイルス媒介性遺伝子送達は、排除されない。
【0037】Caｓタンパク質またはCaｓタンパク質コード核酸およびガイドRNAを含有10する本RGEN組成物は、標的に対するガイドRNAの特異性およびCaｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性のため、標的DNAを特異的に切断し得る。
本明細書において用いられる場合、
「切断」という用語は、ヌクレオチド分子の共有結合骨格の切断を指す。
15本発明では、ガイドRNAは、切断されるべき任意の標的に特異的であるように調製されうる。従って、本RGEN組成物は、ガイドRNAの標的特異的部分を操作または遺伝子型決定することによって、任意の標的DNAを切断し得る。
【0039】本発明では、組成物は、inｖiｔｒｏでの真核細胞または真核生物のゲノム20の遺伝子型決定に使用されうる。
1つの特定の実施形態では、ガイドRNAは、配列番号1のヌクレオチド配列を含みうるが、そのヌクレオチド位置3〜22の部分は標的特異的部分であり、従ってこの部分の配列は標的に応じて変化しうる。
本明細書において用いられる場合、真核細胞または真核生物は、当技術分野にお25いて一般的に用いられる、酵母、真菌類、原生生物、植物、高等植物、ならびに昆虫、または両生類細胞、またはCHO、HeLa、HEK293、およびCOS-56 1などの哺乳類細胞、例えば、培養細胞(inｖiｔｒｏ)、移植細胞および初代培養細胞(inｖiｔｒｏおよびeｘｖiｖｏ)、およびinｖiｖｏ細胞、
ならびにヒトなどの哺乳類細胞でもありうるが、それらに限定されない。
【0040】51つの特定の実施形態では、Caｓ9タンパク質/一本鎖ガイドRNAは、inｖiｔｒｏおよび哺乳類細胞内で部位特異的DNA二本鎖切断を生じることができ、
その自発的修復が、高頻度で標的化ゲノム突然変異を誘発することが見出された。
更に、Caｓ9タンパク質/ガイドRNA複合体またはCaｓ9mRNA/ガイドRNAの1細胞期胚への注入によって、遺伝子ノックアウトマウスが誘導され10得ること、および生殖細胞系列に伝達可能な突然変異がCaｓ9/ガイドRNAシステムによって生じ得ることが見出された。
Caｓタンパク質をコードする核酸よりもむしろCaｓタンパク質を用いて、標的化突然変異生成を誘発することは、外来性DNAが生物内に導入されないため、
有利である。従って、Caｓタンパク質およびガイドRNAを含有する組成物は、
15治療薬または付加価値のある農作物、家畜、家禽、魚、ペットなどの開発に使用されうる。
【実施例1】【0058】ゲノム編集アッセイ201-1.Caｓ9タンパク質のDNA切断活性初めに、化膿性連鎖球菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｐｙｏgenｓ)に由来するCaｓ9のDNA切断活性をinｖiｔｒｏでのキメラガイドRNAの存在下または非存在下で試験した。
この目的のために、E.cｏliで発現され、精製された組換えCaｓ9タンパ25ク質を用いて、23塩基対(bｐ)のヒトCCR5標的配列を含む前消化されたプラスミドDNAまたは環状プラスミドDNAを切断した。Caｓ9標的配列は、c57 ｒRNAまたはキメラガイドRNAと相補的な20-bｐのDNA配列およびCaｓ9自身によって認識されるトリヌクレオチド(5′-NGG-3′)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)で構成される(図1a)。
【0059】5具体的には、化膿性連鎖球菌(Sｔｒeｐｔｏcｏccｕｓｐｙｏgenｓ)株M1GAS(NC_002737.1)に由来するCaｓ9コード配列(4,104bｐ)を、ヒトコドン使用表を用いて再構成し、オリゴヌクレオチドを用いて合成した。初めに、
重複する〜35-meｒオリゴヌクレオチドおよびPhｕｓiｏnポリメラーゼ(NeｗEnglandBiｏlabｓ)を用いて1-kbDNAセグメントを組み立て、T10-ベクター(SｏlGenｔ)にクローニングした。4つの1-kbｐDNAセグメントを用いて、オーバーラップPCRによって、完全長Caｓ9配列を組み立てた。Caｓ9コードDNAセグメントを、
(Inｖiｔｒｏgen)に由来するｐ3ｓにサブクローニングした。このベクターにおいて、HAエピトープおよび核局在化シグナル(NLS)を含むペプチドタグ(NH2-GGSGPPKKKRKV15YPYDVPDYA-COOH、配列番号2)を、Caｓ9のC末端に付加した。
Caｓ9タンパク質のHEK293T細胞における発現および核局在化を、抗HA抗体(SanｔaCｒｕｚ)を用いたウェスタンブロッティングによって確認した。
【0060】20その後、Caｓ9カセットをｐET28-b(+)にサブクローニングして、BL21(DE3)に形質転換した。0.5mMIPTGを用いて25℃で4時間、
Caｓ9の発現を誘導した。C末端にHiｓ6-タグを有するCaｓ9タンパク質を、Ni-NTAアガロース樹脂(Qiagen)を用いて精製し、20mMHEPES(ｐH7.、
5)150mMKCl、1mMDTT、および10%グ25リセロールに対して透析した(1)。精製したCaｓ9(50nM)を、スーパーコイルプラスミドDNAまたは前消化プラスミドDNA(300ng)およびキメラ58 RNA(50nM)とともに、20μlの反応容量のNEBバッファー3中で、37℃で1時間インキュベートした。消化されたDNAを、0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動によって分析した。
Caｓ9は、合成RNAの存在下でのみ、予想された位置で効率的にプラスミド5DNAを切断し、標的配列のない対照プラスミドを切断しなかった(図1b)。
【0061】1-2.ヒト細胞でのCaｓ9/ガイドRNA複合体によるDNA切断RFP-GFPレポーターを用いて、Caｓ9/ガイドRNA複合体が哺乳類細胞においてRFPとGFP配列の間に組み込まれた標的配列を切断できるかどうか10を調べた。
このレポーターでは、GFP配列は、フレームシフトしてRFP配列と融合している(2)。活性を有するGFPは、標的配列が部位特異的ヌクレアーゼによって切断され、エラーを起こしやすい二本鎖切断(DSB)の非相同末端結合(NHEJ)修復によって、標的配列付近にフレームシフトを起こす小さな挿入または欠失(i15ndel)を生じた場合のみに発現する(図2)。
【0062】この研究に使用されるRFP-GFPレポータープラスミドは、以前に記載されたように構築された(2)。標的部位に対応するオリゴヌクレオチド(表1)を合成し(Macｒｏgen)、アニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドを、Ec20ｏRIおよびBamHIで消化したレポーターベクターにライゲーションした。
HEK293T細胞に、Liｐｏfecｔamine2000(Inｖiｔｒｏgen)を用い、24ウェルプレート中で、Caｓ9コードプラスミド(0.8μg)およびRFP-GFPレポータープラスミド(0.2μg)を同時トランスフェクトした。
【0063】25一方、inｖiｔｒｏ転写されたキメラRNAは、下記のように調製した。MEGAｓhｏｒｔｓcｒiｐｔT7キット(Ambiｏn)を用い、メーカーの説明書に従ったラ59 ン・オフ反応によって、RNAをinｖiｔｒｏ転写した。RNAのinｖiｔｒｏ転写のための鋳型は、2つの相補的な一本鎖DNAのアニーリングによって、
またはPCR増幅によって生成された(表1)転写されたRNAを8%変性尿素-。
PAGEゲル上で分離した。RNAを含むゲル切片を切り出し、プローブ溶出バッ5ファーに移した。RNAをヌクレアーゼを含まない水に回収し、続いてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈澱を行った。精製したRNAを分光分析によって定量した。
【0064】トランスフェクションの12時間後、inｖiｔｒｏ転写によって調製された10キメラRNA(1μg)Liｐｏfecｔamine2000を用いてトランスフェクトした。
を、
トランスフェクションの3日後、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーに供し、RFPとGFPとの両方を発現している細胞を計測した。
GFP発現細胞は、細胞が最初にCaｓ9プラスミドによってトランスフェクトされ、その12時間後にガイドRNAによってトランスフェクトされた場合にのみ15得られることが見出され(図2)RGENが培養ヒト細胞中の標的DNA配列を認、
識して切断できることが実証された。このように、GFP発現細胞は、同時トランスフェクションよりもむしろCaｓ9プラスミドおよびガイドRNAの連続トランスフェクションによって得られた。
・・・20【0065】1-3.哺乳類細胞の内在性遺伝子のRGENによる標的破壊RGENが哺乳類細胞の内在性遺伝子の標的破壊に使用され得るかどうかを試験するために、野生型と突然変異体DNA配列のハイブリダイゼーションによって形成されるヘテロ二本鎖を特異的に認識して切断するミスマッチ感受性エンドヌクレ25アーゼであるT7エンドヌクレアーゼI(T7E1)を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離したゲノムDNAを分析した(3)。
60 RGENを用いて哺乳類細胞にDSBを導入するために、4D-Nｕcleｏfecｔｏｒ、SFCellLine4D-NｕcleｏfecｔｏｒXKiｔ、PｒｏgｒamFF-120(Lｏnｚa)を用い、メ6ーカーのプロトコールに従って、2×10K562細胞に20μgのCaｓ9コードプラスミドをトランスフェクトした。この実験のために、K562(ATCC、
5CCL-243)細胞を、10%FBSならびにペニシリン/ストレプトマイシン混合物(それぞれ、100U/mlおよび100μg/ml)を含むRPMI-1640中で増殖させた。
【0066】24時間後、10〜40μgのinｖiｔｒｏ転写されたキメラRNAを、1610×10K562細胞にヌクレオフェクト(nｕcleｏfecｔed)した。inｖiｔｒｏ転写されたキメラRNAは、実施例1-2に記載されたように調製された。
RNAトランスフェクションの2日後に細胞を回収し、ゲノムDNAを単離した。
標的部位を含む領域を、表1に記載されるプライマーを用いてPCR増幅した。アンプリコンを、以前に記載されたようなT7E1アッセイに供した(3)。配列解析15のために、ゲノム改変に相当するPCR産物を精製し、T-BlｕnｔPCRClｏningKiｔ(SｏlGenｔ)を用いてT-Blｕnｔベクターにクローニングした。M13プライマーを用いて、クローニングされた産物を配列決定した。
【0067】突然変異は、細胞がCaｓ9コードプラスミド、その後ガイドRNAによって連20続的にトランスフェクトされた場合にのみ誘発されることが見出された(図3)相。
対的なDNAバンド強度から推定される突然変異頻度(図3aのIndelｓ(%))は、RNA用量依存的であり、1.3%〜5.1%であった。PCRアンプリコンのDNA配列解析は、内在性部位でのRGEN仲介性突然変異の誘発を裏付けた。エラーを起こしやすいNHEJの特徴であるIndelおよびマイクロホモロジーが、
25標的部位で観察された。直接配列決定によって測定された突然変異頻度は、3%7.(=7突然変異体クローン/96クローン)であり、ジンクフィンガーヌクレアー61 ゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)によって得られるものと同程度であった。
細胞に突然変異を誘発するためには、Caｓ9プラスミドおよびガイドRNAの連続トランスフェクションが必要であった。しかし、ガイドRNAをコードするプ5ラスミドの場合、連続トランスフェクションは不要であり、細胞はCaｓ9プラスミドおよびガイドRNAコードプラスミドによって同時トランスフェクトされた。
【0068】その一方で、ZFNとTALENとの両方は、HIV感染の必須の共受容体であるGタンパク質共役ケモカイン受容体をコードする、ヒトCCR5遺伝子を破壊す10るための開発に成功している(3〜6)。CCR5特異的ZFNは、現在米国でAIDS治療のための臨床試験中である(7)。しかし、これらのZFNおよびTALENは、オフターゲット作用を有し、それは、その配列がオンターゲット配列と相同である部位での局所的突然変異(6、8〜10)、ならびにオンターゲット部位およびオフターゲット部位に引き起こされた2つの同時に起こるDSBの修復から生じ15るゲノム再配列(11〜12)の両方を含む。これらのCCR5特異的人工ヌクレアーゼと関連する最も顕著なオフターゲット部位は、CCR5の近縁ホモログであり、CCR5の15-kbｐ上流に位置する、CCR2遺伝子座に存在する。CCR2遺伝子におけるオフターゲット突然変異、ならびにCCR5オンターゲット部位とCCR2オフターゲット部位との間の15-kbｐ染色体セグメントの望まし20くない欠失、逆位、および重複を避けるため、本発明者らは、CCR2配列と明白な相同性を持たないCCR5配列内の領域を認識するように、我々のCCR5特異的RGENの標的部位を意図的に選択した。
【実施例2】【0071】25タンパク質性のRGENによって仲介されるゲノム編集RGENは、多くの異なる形態で細胞内に送達され得る。RGENは、Caｓ962 タンパク質、cｒRNA、およびｔｒacｒRNAで構成される。2つのRNAは、
一本鎖ガイドRNA(ｓgRNA)を形成するように融合され得る。CMVまたはCAGなどのプロモーターの制御下でCaｓ9をコードするプラスミドは、細胞内にトランスフェクトされ得る。cｒRNA、ｔｒacｒRNA、またはｓgRNA5はまた、これらのRNAをコードするプラスミドを用いて細胞内で発現され得る。
しかし、プラスミドの使用は、しばしば、プラスミド全体または一部の宿主ゲノムへの組込みを引き起こす。プラスミドDNAに組み込まれた細菌の配列は、inｖiｖｏでの望ましくない免疫反応を引き起こし得る。細胞療法のためにプラスミドをトランスフェクトされた細胞またはDNAトランスフェクト細胞に由来する動物10および植物は、ほとんどの先進国において販売承認の前に、コストがかかり長期にわたる規制手続を通過しなくてはならない。更に、プラスミドDNAは、トランスフェクション後数日間細胞内に残存し、RGENのオフターゲット作用を悪化させ得る。
【0072】15ここで、我々は、inｖiｔｒｏ転写されたガイドRNAと複合体を形成した組換えCaｓ9タンパク質を用いて、ヒト細胞の内在性遺伝子の標的破壊を誘発した。ヘキサヒスチジンタグと融合された組換えCaｓ9タンパク質を、E.cｏli内で発現させ、標準的なNiイオンアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過を用いて精製した。精製された組換えCaｓ9タンパク質を、保存バッファ20ー(20mMHEPESｐH7.5、150mMKCl、1mMDTT、および10%グリセロール)中で濃縮した。Caｓ9タンパク質/ｓgRNA複合体を、ヌクレオフェクション(nｕcleｏfecｔiｏn)によってK562細胞に直接導入した。すなわち、4D-Nｕcleｏfecｔｏｒ、SFCellLine4D-NｕcleｏfecｔｏｒXKiｔ、Pｒｏgｒa25mFF-120(Lｏnｚa)を用い、メーカーのプロトコールに従って、100μlの溶液中の、100μg(29μM)のinｖiｔｒｏ転写されたｓgR63 NA(またはcｒRNA40μgおよびｔｒacｒRNA80μg)と混合された22.5〜225(1.4〜14μM)のCaｓ9タンパク質を1×106K562細胞にトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を6ウェルプレート中の増殖培地に入れ、48時間インキュベートした。2×105K5625細胞を1/5にスケールダウンした方法でトランスフェクトした場合は、6〜60μgのinｖiｔｒｏ転写されたｓgRNA(またはcｒRNA8μgおよびｔｒacｒRNA16μg)と混合された4.5〜45μgのCaｓ9タンパク質を用いて、20μlの溶液中でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトされた細胞を、その後、48ウェルプレート中の増殖培地に入れた。48時間後、細胞を10回収し、ゲノムDNAを単離した。標的部位にわたるゲノムDNA領域をPCR増幅し、T7E1アッセイに供した。
【0073】図10に示すように、Caｓ9タンパク質/ｓgRNA複合体は、ｓgRNAまたはCaｓ9タンパク質の用量依存的に4.8〜38%の頻度でCCR5遺伝子座15に標的化突然変異を誘発し、これはCaｓ9プラスミドのトランスフェクションによって得られる頻度(45%)と同程度であった。タンパク質/cｒRNA/ｔｒacｒRNA複合体は、9.4%の頻度で突然変異を誘発することができた。Ca5ｓ9タンパク質単独では、突然変異を誘発できなかった。2×10細胞を1/5にスケールダウンした用量のCaｓ9タンパク質およびｓgRNAでトランスフェ20クトした場合、CCR5遺伝子座での突然変異頻度は、用量依存的に2.7〜57%に及び、Caｓ9プラスミドおよびｓgRNAプラスミドの同時トランスフェクションによって得られた頻度(32%)より高かった。
【0074】我々はまた、ABCC11遺伝子を標的とするCaｓ9タンパク質/ｓgRNA25複合体をも試験し、この複合体が35%の頻度でindelを誘発することを見出し、この方法の汎用性を実証した。
64 【実施例3】【0075】マウスにおけるRNA誘導型ゲノム編集・・・5【実施例4】【0087】植物におけるRNA誘導型ゲノム編集・・・【実施例5】10【0092】細胞透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインを用いたCaｓ9タンパク質形質導入・・・【実施例6】15【0100】ガイドRNA構造によるオフターゲット突然変異の制御【実施例7】【0102】ペアードCaｓ9ニッカーゼ20・・・【実施例8】【0105】ペアードCaｓ9ニッカーゼによって誘発される染色体DNAスプライシング・・・25【実施例9】【0109】65 CRISPR/Caｓに由来するRNA誘導型エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子型決定・・・【0129】5参考文献1.M.Jinekeｔal.,Science337,816(Aｕg17,2012).66 【図1a】【図1b】67 【図3a】【図4a】68 【図4b】【図4c】69 【図10a】70 (別紙2)引用文献1の記載事項(抜粋・訳文)[816頁表題]5細菌の獲得免疫におけるプログラム可能な二重RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ[816頁要約]クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復(CRISPR)/10CRISPR関連(Caｓ)系は、CRISPRRNA(cｒRNA)を用いて、
侵入する核酸のサイレンシングを誘導することで、ウイルスやプラスミドに対する獲得免疫を細菌や古細菌に提供する。ここで私たちは、これらの系の一部において、
成熟cｒRNAが、トランス活性化cｒRNA(ｔｒacｒRNA)と塩基対になって2つのRNAからなる構造を形成し、CRISPR関連タンパク質Caｓ9に15標的DNAの二本鎖切断を指示することを示す。
・・・このデュアル-ｔｒacｒRNA:cｒRNAは、一本鎖RNAキメラとして設計されたときも、配列特異的に、
Caｓ9による二本鎖DNA切断を誘導する。私たちの研究は、部位特異的DNA切断のためにデュアル-RNAを使用するエンドヌクレアーゼのファミリーを明らかにし、RNAでプログラム可能なゲノム編集のためにこのシステムを利用する可20能性を強調する。
[816頁中欄25ないし35行目]ここで私たちは、U型の系において、Caｓ9タンパク質が、標的二本鎖DNAを切断するために、活性化ｔｒacｒRNAと標的指向cｒRNAの間の塩基対構造25を必要とする酵素ファミリーを構成するものであることを示す。位置特異的切断は、
標的であるプロトスペーサーDNAとcｒRNAの間の塩基対を形成する相補性と、
71 標的DNAの領域に並置される短いモチーフ[プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる]により定められる場所で生じる。
[816頁中欄35行目ないし右欄3行目]5私たちの研究は、さらに、特定のDNA部位を切断するCaｓ9エンドヌクレアーゼ・ファミリーが、単一のRNA分子によってプログラムされ得るため、それを応用してゲノム標的化及びゲノム編集のための二本鎖DNA切断を引き起こす、単純かつ汎用的なRNA誘導型システムを開発することができるという刺激的な可能性を示している。
10[816頁右欄19ないし25行目]私たちは、成熟cｒRNA単独では、Caｓ9に触媒されるプラスミドDNAの切断を導けないことを発見した。
・・・しかしながら、cｒRNAの反復配列と対を形成し、この系においてcｒRNAの成熟に必要不可欠であるｔｒacｒRNAを追15加することが、Caｓ9がプラスミドDNAを切断することの引き金となった。
[816頁右欄26ないし28行目]この切断反応には、マグネシウムおよびDNAに相補的なcｒDNAの存在の両方が必要であった。
20[820頁左欄2ないし5行目]・・・単一のRNA誘導型Caｓ9の実現性は、プログラムされたDNA切断およびゲノム編集において潜在的に有用であるため、魅力的である・・・。
25[820頁左欄5ないし18行目]私たちは、標的認識配列を5′末端に含み、その下流にｔｒacｒRNAとcｒR72 NAの間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含む2つのバージョンのキメラRNAを設計した(図5B)・・・プラスミドDNAを用いた切断アッセ。
イにおいて、長い方のキメラRNAは、切断されたｔｒacｒRNA:cｒRNA複合体を用いた場合に観察された場合と同じような挙動で、Caｓ9によるDNA5切断を誘導できることを観察によって確認した(図5B並びに図S14A及びC)。
[820頁図5]図5Caｓ9は、ｔｒacｒRNAとcｒRNAの特徴を組み合わせた単一のエンジニアリングされたRNA分子を使用して、プログラムすることができる。(A)10(上)U型CRISPR/Caｓシステムにおいて、Caｓ9は、活性化しているｔｒacｒRNA及び標的化cｒRNAにより形成される2つのRNA構造により誘導されて、部位特異的に標的となった二本鎖DNAを切断する(図S1参照)下)(。
cｒRNAの3′末端をｔｒacｒRNAの5′末端に融合することにより生成されたキメラRNA。
15[820頁左欄29行目ないし中欄14行目]最後に、キメラRNAの設計が普遍的に適用可能であるかどうかを確認するために、
緑色蛍光タンパク質(GFP:gｒeenflｕｏｒeｓcenｔｐｒｏｔein)をコードする遺伝子の一部を標的とする5種類の異なるキメラ誘導RNAを設計し(図S15、AとC)、
20GFPコード配列を有するプラスミドに対するそれらの有効性をインビトロで試験した。全5例において、これらのキメラRNAでプログラムされたCaｓ9は、正確な標的部位でプラスミドを効率的に切断し(図5DおよびS15D)キメラRN、
Aの合理的な設計が堅牢であること、および原理的には、標的配列に隣接するGGジヌクレオチドの存在を越えてほとんど制限なく任意のDNA配列の標的化を可能25とし得ることを示した。
73 [820頁右欄2ないし9行目]ジンク-フィンガーヌクレアーゼや転写活性化様エフェクターヌクレアーゼは、ゲノムを操作するために設計された人工酵素として、大きな関心を集めた。私たちは、
遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大きな潜在能力をもたらし得5るRNAによりプログラムされたCaｓ9に基づく代替的な手法を提案する。
[「SUPPLEMENTARYMATERIALSANDMETHODS」の「PlaｓmidDNAcleaｖageaｓｓaｙ」]プラスミドDNA切断アッセイ10・・・未処理の、あるいは制限酵素処理により鎖状化されたプラスミドDNA(300ng(〜8nM))は、精製されたCaｓ9タンパク質(50〜500nM)とｔｒacｒRNA:cｒRNA複合体(50〜500nM、1:1)とともに、Caｓ9プラスミド切断緩衝液(20mMHEPESｐH7.5、150mMKCL、0.5mMDTT、0.1mMEDTA)中で、10mMMgCl2を15加えて、あるいは加えずに、37℃で60分間インキュベートした。
[「SUPPLEMENTARYMATERIALSANDMETHODS」の「Meｔal-deｐendenｔcleaｖageaｓｓaｙ」]金属依存性切断アッセイ20・・・。
[「SUPPLEMENTARYFIGURES」]2+図S4.Caｓ9は3′―5′エクソヌクレアーゼ活性を有する、Mg依存性のエンドヌクレアーゼである。
2574 [820頁図5A]75
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