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関連審決 不服2013-25515
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事件 平成 27年 (行ケ) 10188号 審決取消請求事件

原告 ラプトールファーマシューティカル インコーポレイテッド
訴訟代理人弁護士 山本健策 草深充彦 難波早登至 弁理士 長谷部真久
被告特許庁長官
指定代理人中島庸子 三原健治 井上猛 田中敬規
裁判所 知的財産高等裁判所
判決言渡日 2016/09/21
権利種別 特許権
訴訟類型 行政訴訟
主文 １ 原告の請求を棄却する。
２ 訴訟費用は原告の負担とする。
３ この判決に対する上告及び上告受理申立てのための付加期間を３０日と定める。
-1-事 実 及 び 理 由第１ 原告の求めた裁判特許庁が不服２０１３−２５５１５号事件について平成２７年５月８日にした審決を取り消す。
第２ 事案の概要本件は，特許出願に対する拒絶査定不服審判請求を不成立とした審決の取消訴訟である。争点は，実施可能要件（特許法36条4項1号）違反についての判断の当否である。
１ 特許庁における手続の経緯原告は，名称を「環状受容体関連蛋白ペプチド」とする発明につき，平成２０年３月２１日を国際出願日（本件出願日）として，特許出願（特願２０１０−５０１１２６号）をし（パリ条約に基づく優先権主張 平成１９年３月２１日・アメリカ合衆国）（甲２），平成２５年７月１９日に手続補正をした（甲７）。
原告は，平成２５年１２月２６日，拒絶査定不服審判請求をし（不服２０１３−２５５１５号。甲１０），同日，手続補正（本件補正。甲１１）をした。
特許庁は，平成２７年５月８日，「本件審判の請求は，成り立たない。」との審決をし，同審決謄本は，同月２０日，原告に送達された。
２ 本願発明の要旨本件補正後の特許請求の範囲の請求項１記載の発明（本願発明）は，以下のとおりである（甲１１）。
「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含み，そして１ｘ１０−８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合する，８５アミノ酸長以下である環状ＲＡＰペプチドであって，該ＣＲ含有蛋白は，ＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０），ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７），ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２），ＬＲＰ２（Ｐ-2-９８１６４），ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４），ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６），ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７），ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１），ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４），ソルチリン関連受容体，ＳｏｒＬＡ（Ｑ９２６７３），ＬＲＰ１０（Ｑ７Ｚ４Ｆ１），ＬＲＰ１１（Ｑ８６ＶＺ４），ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１），ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０），ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５），ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４，Ｑ８ＷＶＣ１），ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７），ＴＭＰＳ４（Ｑ９ＮＲＳ４），ＴＭＰＳ６（Ｑ８ＩＵ８０），Ｑ６ＩＣＣ２，Ｑ６ＰＪ７２，Ｑ７６Ｂ６１，Ｑ７ＲＴＹ８，Ｑ７Ｚ７Ｋ９，Ｑ８６ＹＤ５，Ｑ８ＮＡＮ７，Ｑ８ＮＢＪ０，Ｑ８ＷＷ８８，Ｑ９６ＮＴ６，Ｑ９ＢＹＥ１，Ｑ９ＢＹＥ２，Ｑ９ＮＰＦ０及びｃｏｒｉｎ（Ｑ８ＩＺＲ７）よりなる群から選択される，環状ＲＡＰペプチド。」３ 審決の理由の要点本願明細書には，本願発明に包含される環状ＲＡＰペプチドとして，５個までのアミノ酸変異を有する数個のペプチドを製造したことが記載されているにとどまり，「配列番号９７のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含み，８５アミノ酸長以下である環状ＲＡＰペプチド」であれば，「１ｘ１０−８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合し，該ＣＲ含有蛋白は列挙された３４個の群から選択される」ことの合理的な説明も記載されていない。
一方，受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化することが本件出願日当時の技術常識であり，そのことは，本願明細書の実施例１１（判決注：実施例１の誤記と思われる。）でも，ＲＡＰペプチドの１〜５個のアミノ酸を変異させただけで，各ＣＲ含有蛋白との結合親和性が変化したことからもうかがえる。
そうすると，「配列番号９７のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含み，８５アミノ酸長以下である環状ＲＡＰペプチド」であって，「１ｘ１０−８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合し，該ＣＲ含有蛋白は列挙された３４個の群から選択される」という環状ＲＡＰペプチドを製造-3-するためには，本願明細書【００１４】，【００１９】，【００２１】，【００２２】及び【０２３９】の記載，並びに，アミノ酸配列から各ＣＲ含有蛋白との結合親和性を予測できないという本願出願日当時の技術常識を考慮すると，本願明細書の【００１９】に示唆された「２４６，２４７，２４９，２５０，２５１，２５６，２５７，２６１，２６６，２６７，２６８，２７０，２７３，２７９，２８０，２８７，２９０，２９４，２９６，２９７，２９８，３０５，３０８，３１１，３１２，３１３」のいずれかの位置に，１〜１５個（５０個×３０％）の変異を行い，列挙された３４個のＣＲ含有蛋白との結合親和性を調べるという，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を要することは明らかである。
したがって，本願の発明の詳細な説明には，本願発明を当業者が実施できる程度に明確かつ十分に記載されていない。
第３ 原告主張の審決取消事由１ 審決は，実施可能要件（特許法36条4項1号）の判断を誤ったものであるから，取り消されるべきである。
２ 取消事由１（過度の試行錯誤が不要であること）本願発明に係るペプチドを製造するに当たり，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤は必要ではない。
(1) 当業者は，変異しても受容体との結合親和性に影響を及ぼさない多数のアミノ酸を特定した上で，そのようなアミノ酸を除外してペプチドの製造及びその機能性の確認を行うことが可能であった。
本件出願日当時において，ＲＡＰペプチドの受容体結合部位がどこかという点は，当業者にとっての技術常識だったから，当業者は，１〜数個のアミノ酸を変異させても受容体との結合親和性が変化しないＲＡＰペプチドの領域を容易に特定することができた。また，当業者は，どのアミノ酸残基が，多種多様な受容体との結合において重要な役割を担うのかに関する十分な知識を有していた。
-4-そして，アミノ酸のうち，受容体に結合する領域以外に存在するアミノ酸を変異させた場合には，受容体との結合親和性が変化しない。
よって，当業者は，本願発明に係るペプチドの製造に当たり，変異しても受容体との結合親和性に影響を及ぼさないアミノ酸を除外してペプチドの製造及びその機能性の確認の作業をすることが可能である。
したがって，本願発明に係るペプチドを製造するに当たり，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤は必要ない。
(2) 本件補正後の特許請求の範囲の請求項３５（請求項３５）は，２２６，２３０，２３２，２３９，２４１，２４２，２４６，２４７，２４９，２５０，２５１，２５６，２５７，２６１，２６６，２６７，２６８，２７０，２７３，２７９，２８０，２８７，２９０，２９４，２９６，２９７，２９８，３０５，３０８，３１１，３１２，３１３，３１４又は３１５位でのアミノ酸配列の変異を記載している。また，本願明細書【００２０】【００２１】， ，実施例１（【０２０１】）及び表４は，アミノ酸残基のうち，改変されることがあり，かつ，ＬＲＰ１，ＬＲＰ２，マトリプターゼ，ＶＬＤＬＲ，及びＦＤＣ−８Ｄ６に対する選択的結合を与える残基を記載している。
このことからも，当業者は，過度の試行錯誤をすることなく，請求項に包含されるペプチドを容易に合成し，受容体であるＬＲＰ１，ＬＲＰ２，マトリプターゼ，ＶＬＤＬＲ，及びＦＤＣ−８Ｄ６に対する結合親和性について容易に試験することができる。
(3) 本願明細書に記載されている本願発明に係るペプチドの製造方法は，当業者にとって負担となるものではない。
ア 本願明細書の実施例１及び【０２０９】〜【０２２７】に記載されているファージディスプレイ技術及びＰＣＲによるランダム変異誘発を用いるランダム変異誘発スクリーニングは，本件出願日当時の常套の手法であり，慣用的な実験を超えるものとは解されていなかった（甲１５〜１７） したがって，。 本願発明には，-5-多数の（例えば，被告が主張するような最大で１０ ３１個の）クローンが包含され得るが，この数のクローンをスクリーニングするための方法は，当業者が容易に実施可能であった。
変異の有無にかかわらず環状ＲＡＰペプチドを作製する方法は，本願明細書の【０１５３】〜【０１５８】に記載されるとおりである。
イ 例えば，開発業務受託機関（ＣＲＯ）に委託すれば，本願発明に包含されるあらゆるペプチドを合成することが可能である。ＣＲＯは，例えば，２週間程度の短期間に１００個のペプチドを合成することが可能である。そして，個々のＣＲ含有タンパクとの結合親和性を決定するスクリーニングは，本件出願日当時の技術常識を参酌して本願明細書の記載を読んだ当業者が，２週間程度で実施することができる試験である。
したがって，本願発明の実施には，長時間も膨大な費用も必要ではない。
ウ 仮に，本願発明のペプチドについて網羅的に合成して試験した場合に長時間及び膨大な費用がかかったとしても，当業者は慣用的手法によって本願発明ペプチドの網羅的な合成及び試験を容易に行うことができるのだから，本願発明が実施可能要件を充足するという結論に変わりはない。
３ 取消事由２（実施例が十分であること）本願明細書には，本願発明に係るペプチドの製造例が十分に記載されている。
(1) 「パーセント同一」の解釈について審決は，本願明細書においては本願発明に包含される環状ＲＡＰペプチドとして，５個までのアミノ酸変異を有する数個のペプチドしか製造されていないと認定するが，誤っている。
アミノ酸の変異には，アミノ酸残基の置換のみならず，アミノ酸残基の欠失も含まれる。そして，本件出願日当時の当業者は，アミノ酸配列相互の同一性を判断するに当たり，長いペプチドを全長として配列同一性を判断するという手法を用いていた（甲１４）。仮に，短いペプチドを全長として配列同一性を判断すると，長いペ-6-プチドと，長いペプチドに含まれるわずか数残基の短いペプチドとの間の配列同一性が常に１００％となるにもかかわらず，そのような短いペプチドは長いペプチドが有する機能を有しない蓋然性が高く，配列同一性が１００％であるにもかかわらず，機能を保持していないペプチドが多数存在し，不合理である。
下記(2)で述べるとおり，本願明細書に記載されるｍＲＡＰ−１４ｃは，３個のアミノ酸が変化した６０アミノ酸の短縮型ペプチドだから，本願明細書には，配列番号９７の７１残基に対して５７残基が同一であるペプチド，すなわち，８０％の同一性を示すペプチドが具体的に記載されている。
(2) 本願明細書に記載されている本願発明に係るペプチドの製造例本願明細書の実施例３及び４は，様々なＣＲ含有蛋白に結合する変異されたＲＡＰペプチドの短縮型（ｍＲＡＰｃ（７５アミノ酸長），ｍＲＡＰｃｋｏ（７５アミノ酸），ｍＲＡＰ−８ｃ（６７アミノ酸長），ヘプタイド（６８アミノ酸長）及びｍＲＡＰ−１４ｃ（６０アミノ酸長））を示し，これらの変異されたＲＡＰペプチドについて，そのそれぞれの受容体に対する結合親和性を示している。また，本願明細書は，ペプチドの長さ６０〜７５アミノ酸で変化させ，様々なアミノ酸変異を含めても，所望の受容体結合活性を有することを示す例を提供している。例えば，ＲＡＰの残基２５０−３０９と変異Ｆ２５０Ｃ，Ｌ３０８Ｇ及びＱ３０９Ｃとを含むｍＲＡＰ−１４ｃは，配列番号９７と比較して１４の変化を有し（１１アミノ酸残基短く，かつ，３つの置換変異を含む。，配列番号９７に８０％の同一性を有する。
）また，アミノ酸の変異には，アミノ酸残基の置換のみならず，アミノ酸残基の欠失も含まれるのであるから，本願明細書には，５残基よりも多くの残基を変異させたＲＡＰ改変体が記載されているというべきである。例えば，本願明細書に記載されるｍＲＡＰ−１４ｃは，３個のアミノ酸が変化した６０アミノ酸の短縮型ペプチドであるから，合計１４アミノ酸残基が異なるため，配列番号９７の７１残基に対して５７残基が同一であるペプチド，すなわち，８０％の同一性を示すペプチドである。
-7-さらに，本願明細書の実施例４は，本願発明に係るペプチドであるｍＲＡＰ−１４ｃが受容体ＬＲＰ１に対して約２１ｎＭの結合親和性で結合することを示している。ヘプタイドは，ＲＡＰの２４６番目のアミノ酸残基〜３１３番目のアミノ酸残基に由来し，５つのアミノ酸置換（Ｅ２４６Ｃ，Ｌ２４７Ｇ，Ｇ２８０Ａ，Ｌ３１１Ａ，及びＳ３１２Ｃ）を含んでいる。すなわち，ｍＲＡＰ−１４ｃは，配列番号９７と８アミノ酸残基が異なり，約３．５ｎＭの結合親和性で受容体であるＬＲＰ１に結合するペプチドであり，本願発明に係るペプチドである。
この他にも，多数のＲＡＰペプチド変異体（例えば，ｍＲＡＰｃ及びｍＲＡＰｃｋｏは７５アミノ酸長であり，ｍＲＡＰ−８ｃは６７アミノ酸長であり，ヘプタイドは６８アミノ酸長であり，ｍＲＡＰ−１４ｃは６０アミノ酸長である。）と，種々のＣＲ含有蛋白との組合せが本願明細書に記載されている。本願明細書の図９においても，ＲＡＰペプチド短縮型が結合親和性を増加させることが示されている。
以上のとおり，本願明細書には，本願発明に係るペプチドの製造についての実施例が数多く記載されており，本願発明は実施可能要件を満たしている。
４ 取消事由３（審決が指摘する技術常識が存在していなかったこと）本件出願日において，審決において指摘されている「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化する」との技術常識は存在していなかった。
審決は，本件出願日当時，「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変化させただけでも，受容体との結合親和性が変化する」との技術常識が存在していたことを前提として，本願発明に係るペプチドを取得するに際しては当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤が必要となる旨認定している。
しかし，本願明細書の【０２３２】に「これら２部位以外では多様な置換パターンを有していた」との記載があることなどから明らかなように，受容体との結合親和性に影響を与えない多数のアミノ酸変異が存在することから，アミノ酸を変化さ-8-せることによって受容体との結合親和性が変化する蓋然性は高くなく，そのような技術常識が存在するとはいえない。なお，審決は，そのような技術常識が存在することの根拠として，本願明細書の実施例１を取り上げるが，実施例１は，本願明細書が受容体との結合親和性に影響を与えるアミノ酸変異の同定に焦点を当てたものであるため，結合親和性が変化した変異を同定して記載したにすぎず，これを一般化して，１〜数個のアミノ酸を変化させただけで受容体との結合親和性が変化するとの結論を導くことはできない。
本件出願日当時において，ＲＡＰペプチドの受容体結合部位がどこかという点は，当業者にとっての技術常識であった（甲１８，２０，２１）から，当業者は，１〜数個のアミノ酸を変異させても受容体との結合親和性が変化しないＲＡＰペプチドの領域を容易に特定することができた。また，当業者は，本件出願日当時，どのアミノ酸残基が，多種多様な受容体との結合において重要な役割を担うのかに関する十分な知識を有していた。
したがって，本件出願日当時，「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化する」との技術常識は存在していなかったから，本願発明に係るペプチドを取得するのに際して当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤が必要になるとの結論を導くことはできない。
５ 取消事由４（疾患又は障害の処置のための実施例等が記載されていること）(1) 本願明細書は，環状ＲＡＰペプチドをどのように細胞及び動物に投与するかを教示しており，当該ペプチドがインビトロで細胞に治療剤を送達し，インビボで取り込まれることを示している（実施例５【０２６２】，実施例６【０２６９】及び実施例８【０２７７】等）。
これらの結果は，標的とされた細胞型における受容体に対する環状ＲＡＰペプチドが，細胞型が関与する疾患を処置するのに有用であることを示唆している。
(2) また，本願明細書は，疾患におけるＣＲ含有蛋白の関連性を教示している-9-（【０００７】〜【０００９】，【００７９】〜【００８７】参照）し，治療剤に結合された環状ＲＡＰペプチドによる治療が企図される疾患や，記載されている治療が有効であろう症状についても記載している 【００８８】 【０１１５】（ 〜 参照）。
そして，本願明細書中で実証された環状ＲＡＰペプチドの取り込みと，ＲＡＰペプチドを含むペプチドの疾患の治療のための投与に関する当該分野の技術常識とに鑑みれば，本願発明に係るペプチドを用いる疾患の治療については，十分に記載がなされているというべきである。
さらに，特表２００７−５２６２２７号公報（甲８の５頁以下）【００１１】，【０２４２】及び【０２８９】には，ＲＡＰ融合蛋白質が酵素を線維芽細胞に送達することや，モデル血液脳関門系を横切って薬剤を中枢神経系に送達するトランスサイトーシスが記載されているし，ＲＡＰペプチドの投与方法は，本願明細書【０１７８】〜【０１９８】に記載されており，中枢神経系への投与は【０１８５】等に記載されている。
以上より，本願明細書には，疾患又は障害の処置のための本願発明の実施方法及び実施例が詳細に記載されている。
第４ 被告の反論１ 取消事由１について(1)ア 原告は，アミノ酸のうち，受容体に結合する領域以外に存在するアミノ酸を変異させた場合には，受容体との結合親和性が変化しないことを前提に，当業者は，本件出願日当時，ＲＡＰ受容体結合部位がどこかということを特定することができ，どのアミノ酸残基がどの受容体との結合に関わるのかを知っていたから，本願発明に係るペプチドを製造するに当たり，どのアミノ酸残基に変異導入すべきかを理解していた，と主張する。
イ しかし，アミノ酸のうち，受容体に結合する領域以外に存在するアミノ酸を変異させた場合に，受容体との結合親和性が変化しないとはいえない。本願発- 10 -明のペプチドは，配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含むものであるから，最大１５個の変異を包含するものである。そして，本願発明の変異にはアミノ酸の挿入や欠失も含まれているから，たとえ結合親和性には直接関連しない部位の変異であるとしても，数個〜１５個までのアミノ酸が，連続して，あるいは不連続で，挿入され及び／又は欠失された場合には，ペプチドの立体構造が変化して，その結果，受容体との結合親和性が変化しないとはいえない。また，本願発明には，アミノ酸の１５個程度を連続して置換することにより，その変異させた部位が新たな受容体との結合部位となるような変異も包含されている。
原告の主張は，その前提を欠き，失当である。
ウ さらに，ＣＲ含有蛋白がＲＡＰペプチドの受容体結合部位に特異的に結合する場合であっても，その結合親和性は強い場合と弱い場合とがある（特異的に結合しない場合は，そもそも結合親和性など関係ない。 。
）「結合特異性」と「結合親和性」とは，異なるものである。そして，「結合特異性」と「結合親和性」は，いずれもＲＡＰペプチドの受容体結合部位のアミノ酸残基が関与するといえるが，結合「親和性」については，ＲＡＰペプチドの受容体結合部位だけでなく蛋白質全体の構造の影響も受けると考えられる。
そうすると，ＣＲ含有蛋白（ＬＲＰ１）の特異的結合に関与するＲＡＰ側の結合ドメイン（ＲＡＰペプチドの受容体結合部位）について解明されたとしても，それに基づいて，「当業者は，１〜数個のアミノ酸を変異させても受容体との結合親和性が変化しないＲＡＰペプチドの領域を容易に特定することができた」とはいえない。
(2) 原告は，請求項３５に変異を導入すべきアミノ酸配列の位置を示し，本願明細書【００２０】【００２１】， ，実施例１【０２０１】及び表４に，改変されることがあり，かつ，特定のＣＲ含有蛋白に選択的結合を与える残基を記載している，と主張する。
しかし，本願明細書の実施例で製造された９個のペプチドは，いずれも２４６，- 11 -２４７，２４９，２５０，２５１，２５６，２５７，２６６，２７０，２８０，２９６，３０９，３１１及び３１２の１４個のいずれかの位置に，２〜５個のみの変異を有するものであり，しかも，結合するＣＲ含有蛋白によってもその変異の位置が異なるものである。
したがって，本願明細書の上記実施例で製造された特定のペプチドは，「アミノ酸配列に３０％までの変異を行ったＲＡＰペプチド」のごく一部分にすぎない。そして，(1)で述べたとおり，「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化する」ことは，本件出願日当時の技術常識であるから，当業者は，上記の１４個の位置のいずれかに２〜５個の変異を有するペプチド以外のものについても同様に，１×１０ −８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合するかどうか理解できるとはいえない。
また，本願明細書の実施例１，表４には，変異を導入して特定の受容体に対する結合特異性をもたらす残基を列挙しているが，上記(1)のとおり，結合特異性と結合親和性とは異なる。
(3) 原告は，本願明細書に記載されている，ファージディスプレイ技術及びＰＣＲによるランダム変異誘発を用いるランダム変異誘発スクリーニングを用いた本願発明に係るペプチドの製造は，当業者にとって負担となるものではない，と主張する。
ライブラリーの作製方法やスクリーニング方法が当業者によく知られた手段であること自体は，争わない。しかし，本願発明は，スクリーニング方法に関する発明ではなく，「環状ＲＡＰペプチド」という物の発明に関するものである。そして，実際に本願発明で特定される「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含み」「８５アミノ酸長以下である」， 「環状ＲＡＰペプチド」で「１ｘ１０−８Ｍ以下の結合親和性Ｋｄで」あって， ，列挙された３４個の群から選択される「ＣＲ含有蛋白に結合する」という要件を満足する「環状ＲＡＰペプチド」- 12 -を提供（製造）するためには，候補となる無数ともいえる変異体を作製し，３４種のＣＲ含有蛋白質の種類ごとにスクリーニングを行うことが必要であって，そのようなことを審決では「当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を要する」と判断したものである。
したがって，原告の主張にかかわらず，審決が本願明細書の発明の詳細な説明の記載が実施可能要件を満足しないと判断したことに，誤りはない。
(4) 原告は，ＣＲＯは，例えば，２週間程度の短期間に１００個のペプチドを合成することができるし，結合親和性を決定するスクリーニングも，２週間程度で実施することができるし，仮に，本願発明のペプチドについて網羅的に合成して試験した場合に長時間及び膨大な費用がかかったとしても，当業者は慣用的手法によって本願発明ペプチドの網羅的な合成及び試験を容易に行うことができるのであるから，本願発明が実施可能要件を充足するという結論に変わりがない，と主張する。
しかし，本願発明に係るペプチドを製造するためには，１００個程度ではなく無数ともいえるペプチドを網羅的に合成し，その上で，所定の結合親和性Ｋｄで，特定のＣＲ含有蛋白に結合するかどうかを実際に確認するという，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を行わなければならない。長時間及び膨大な費用がかかるのであれば，なおさら，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤というほかない。
２ 取消事由２について(1) 原告は，本願発明の「５０個の連続するアミノ酸」からなるアミノ酸配列との同一性を比較するアミノ酸配列が, ７１個のアミノ酸からなる配列番号９７の「全長」であるとの解釈を前提として，本願明細書には，@５残基よりも多くの残基を変異させたＲＡＰ改変体が記載されている，A配列番号９７の７１残基に対して５７残基が同一であるペプチド，すなわち，８０％の同一性を示すペプチドが具体的に記載されている，と主張する。
しかし，原告の上記主張のように解釈すると，本願発明の「５０個の連続するア- 13 -ミノ酸」が，たとえ配列番号９７の５０アミノ酸からなる部分断片である場合であっても，それらのアミノ酸配列の同一性は５０個／７１個×１００＝７０．４％となる。そして，両者のアミノ酸が１つ異なっただけでも，本願発明の「５０個の連続するアミノ酸」の配列番号９７との同一性は６９％となってしまい，本願発明の「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸」に相当するアミノ酸配列は，７１個のアミノ酸からなる配列番号９７のアミノ酸配列の５「０アミノ酸からなる部分断片」のみとなってしまう。
また，本願発明の請求項１を引用する本件補正後の特許請求の範囲の請求項３には，「成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２５７，２６６，２７０，２７９，２８０，２９６又は３０５位の何れか１つにおける変異を含む請求項１記載の環状ＲＡＰペプチド。」と，１つ以上の変異を含むことが記載されているから，本願発明の「５０個の連続するアミノ酸」からなるアミノ酸配列との同一性を比較する対象が，「７１個のアミノ酸からなる配列番号９７の全長」であるという解釈は，合理的でなく，誤りである。
さらに，「パーセント同一性」について，【００６１】には，「ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の２つ以上に言及する場合の「同一」又は「パーセント同一性」という用語は後述する配列比較アルゴリズムの１つを用いて，又は目視による検査により測定した場合に，最大一致となるように比較してアラインした場合に，同じであるか，又は同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する配列又はサブ配列の２つ以上を指す。好ましくは，パーセント同一性は少なくとも約５０残基長，少なくとも約１００残基，少なくとも約１５０残基である配列の領域に渡って，或いは，比較する生体重合体の一方又は両方の全長に渡って，存在する。」と記載されている。そうすると，本願発明の「５０個の連続するアミノ酸」からなるアミノ酸配列との同一性を比較する対象が「７１個のアミノ酸からなる配列番号９７の全長」であるという解釈は，成り立たず，当該同一性を比較する対象は，本願明細書に記載のとおり，「本願発明の５０個の連続するアミノ酸配列と- 14 -対応する部分の配列番号９７の領域」であると解釈すべきである。
したがって，本願明細書の実施例３及び４におけるヘプタイド及びｍＲＡＰ−８ｃは，配列番号９７に対して８８％の同一性を有するものではなく，ｍＲＡＰ−１４ｃは，配列番号９７に対して８０％ではなく９４％の同一性を有することとなる。
(2) また，原告は，本願明細書には，本願発明に係るペプチドの製造についての実施例が数多く記載されているから，本願発明は実施可能要件を満たす，と主張する。
しかし，本願明細書には，本願発明に包含される環状ＲＡＰペプチドを３個製造したことが記載されており，３個は多数とはいえないばかりか，本願発明に包含される環状ＲＡＰペプチドのごく一部にすぎない。そして，「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化する」ことは，本件出願日当時の技術常識であるから，当業者は，上記の３個の環状ＲＡＰペプチド以外のものについても同様に，１×１０ −８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合するかどうかを理解できるとはいえない。そうすると，本願発明の環状ペプチドを製造するためには，無数ともいえるペプチドを網羅的に合成し，その上で，所定の結合親和性Ｋｄで，特定のＣＲ含有蛋白に結合するかどうかを実際に確認するという，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を行わなければならない。
本願明細書で１〜２個のＣＲ含有蛋白に結合したことが確認されているのは，最大５個のアミノ酸変異を有する（５０個−５個）／５０個×１００＝９０％の同一性の環状ＲＡＰペプチドであり，９０％以下の同一性の環状ＲＡＰペプチドで，かつ，１×１０−８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合するものは，本願明細書には具体的に記載されていない。
３ 取消事由３について原告は，審決が認定した技術常識の内容が，受容体と結合しない領域でのアミノ酸を１〜数個変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化する，というもの- 15 -だとして，これに反論する。
しかし，原告の主張は，審決が，１〜数個のアミノ酸を変異させる領域を受容体等に結合する領域と特定していることを無視したものであるから，失当である。
４ 取消事由４について原告は，本願明細書には，疾患又は障害の処置のための本願発明の実施方法及び実施例が詳細に記載されていることも，本願発明が実施可能要件を満たすことの根拠となると主張する。
しかし，本願発明はペプチドに係るものであり，医薬に係るものではないから，本願発明についての実施可能要件の判断と，本願明細書には，疾患又は障害の処置のための本願発明の実施方法及び実施例が詳細に記載されていることは，直接には関係していない事項である。
また，本願発明について，本願明細書の発明の詳細な説明が，当業者が製造できるように明確かつ十分に記載されているかが争点であり，当業者が使用できるように記載されているかどうかは争点ではなく，審決でもこの点について言及していない。原告の主張は，審決の取消事由と関係しない。
５ 結語以上のとおりであるから，本願明細書の発明の詳細な説明は，当業者が本願発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されているとはいえず，審決には，実施可能要件に違反するという判断についての，原告の主張するような誤りはないから，原告主張の取消事由は理由がない。
第５ 当裁判所の判断１ 本願発明について(1) 請求項３５及び本願明細書（甲２，４，１１）には，以下の記載がある。
【請求項３５】成熟ＲＡＰの以下の位置，即ち：２２６，２３０，２３２，２３９，２４１，２４２，２４６，２４７，２４９，２５０，２５１，２５６，２５７，- 16 -２６１，２６６，２６７，２６８，２７０，２７３，２７９，２８０，２８７，２９０，２９４，２９６，２９７，２９８，３０５，３０８，３１１，３１２，３１３，３１４，または３１５の３つ以上における変異を含む請求項１〜３４の何れか１項に記載の環状ＲＡＰペプチド。
【０００２】（発明の分野）本発明は低密度リポ蛋白受容体関連蛋白（ＲＡＰ）の環状ペプチド，例えばその類縁体，その組成物，およびそのような環状ＲＡＰペプチドを形成する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】【０００３】 ・・・受容体関連蛋白（ＲＡＰ）は低密度リポ蛋白受容体（ＬＤＬＲ）ファミリーの殆ど全てのメンバーに結合する独特の３９ｋＤの蛋白である。小胞体およびゴルジ体に局在化することにより（非特許文献１），ＲＡＰはこれらのファミリーメンバーに対するシャペロンとして作用する。例えばＲＡＰはこれらのコンパートメントないでＬＲＰに堅固に結合することにより同時発現リガンドとの受容体の早期の会合を防止する（非特許文献２）。
【０００４】自身のシグナル配列を含む完全長のヒトＲＡＰは３５７アミノ酸である。成熟ＲＡＰは３２３アミノ酸を含有し，そのうち最後の４アミノ酸（ＨＮＥＬ）が小胞体貯留シグナリングを構成している。ＲＡＰは３つの弱い相同性を有するドメイン（ｄ１，ｄ２およびｄ３）よりなることが報告されている。３つのドメイン全てがＬＲＰと結合できるが，ｄ３が最高の親和性で結合する。・・・【０００５】ＲＡＰのトランケーションおよび／または変異された型が研究されている。
・・・非特許文献９はＬＲＰの種々のフラグメントへの結合に関してＲＡＰｄ３（残基２１６−３２３）を試験している。
・・・非特許文献１２はＲＡＰの残基２０６〜３２３内にランダムな変異を有するクローンを含有するライブラリを構築し，そして，ＲＡＰの２５６位のリジンの変異または２７０位のリジンがＲＡＰのＬＲＰへの結合を根絶したことを報告している。
【０００６】リポ蛋白受容体関連蛋白（ＬＲＰ）受容体ファミリーは広範な種類の生理学的現象を媒介する細胞表面の，膜貫通蛋白のグループを含む。受容体は全- 17 -てＬＤＬＲに相同であり，そして同様のドメイン機構を共有しており，これにはＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたは補体型リピート（ＣＲ）が包含され，それは保存された蛋白配列の大型のファミリーの一部である。
・・・ＣＲ配列はＬＤＬＲファミリーおよびＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ）ファミリーを包含する種々の異なる型の蛋白において観察されている。
【０００９】ＣＲ含有蛋白がこれらのファミリーの一部のメンバーの独特の組織分布プロファイルとともに病態生理学的プロセスにおいて果たしている重要な役割は，これらの蛋白を有用な薬物標的としている。蛋白選択的薬物はターゲティングされた蛋白の機能に対して直接影響を及ぼすことができ，特定の疾患状態に対して蛋白が有している作用を裏付けている。或いは，薬物はターゲティングされた蛋白の組織分布を好都合に利用することにより，疾患を有する特定の組織に対して他の治療分子を効率的に送達することができる。哺乳類の生理学および病態生理学的特徴におけるＣＲ含有蛋白の重要性の多大な証拠にも関わらず，ＬＤＬＲまたはＣＲ含有蛋白ファミリーの特定のメンバーに対して選択的に作用する薬物の例は殆ど無い。これらのファミリーの特定のメンバーに結合する分子を創生する能力は，そのような薬物を開発する手段を提供することになる。
【００１１】哺乳類の生理学的特徴の全体に渡ってＣＲ含有蛋白の広範な関与があるとすれば，ＲＡＰの本来の結合特性を保持しているか，または特定のＣＲ含有蛋白に対して進歩した結合選択性を有し，かつ他の所望の特性，例えば進歩した安定性または生産製造の容易さを呈するＲＡＰフラグメントおよび変異体の必要性が存在する。
【課題を解決する手段】【００１４】補体型リピート（ＣＲ）は特徴的な折り畳み構造を採用している保存された蛋白配列の大型のファミリーである。ＣＲ含有蛋白はＬＤＬ受容体ファミリー，ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ）ファミリー，および他の蛋白，例えばＦＤＣ−８Ｄ６抗原（ＣＤ３２０）のメンバーを包含する。受容体関連蛋白（ＲＡＰ）は高い親和性でこれらのＣＲ含有蛋白の- 18 -多くに結合する。成熟ＲＡＰの３２３アミノ酸配列を配列番号９５に示す。１２３アミノ酸長の成熟ＲＡＰのドメイン３のアミノ酸配列（アミノ酸２０１〜３２３）を配列番号９６に示す。アミノ酸２４３〜３１３は配列番号９７に示す。ＲＡＰのアミノ酸２４９〜３０３は配列番号９８に示す。
【００１５】本発明は高い親和性でＣＲ含有蛋白に結合する環状ＲＡＰペプチド（類縁体または誘導体を包含）そのような環状ペプチドを含むコンジュゲートおよ，び組成物，およびそのようなペプチドの，例えばそのようなＣＲ含有蛋白の阻害剤または増強剤としての，またはそのようなＣＲ含有蛋白を発現する組織への診断薬または治療薬のターゲティング送達のための治療上または診断上の使用を提供する。
環状ＲＡＰペプチドは所望の特性，例えば進歩した親和性，ＣＲ含有蛋白に対する進歩した結合選択性，進歩した安定性，および／または製造の容易さを示す場合がある。
【００１６】本発明の環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰのアミノ酸配列，好ましくはドメイン３に基づいており，好ましくは１２３アミノ酸長未満であり，そして２つの非隣接アミノ酸の間に共有結合を含有する。一部の実施形態においては，共有結合はＲＡＰペプチドの３次元構造を安定化させる。一部の実施形態においては，共有結合は約１×１０ −８ Ｍかそれより低いＫｄでＣＲ含有蛋白に環状ＲＡＰペプチドが結合するような結合親和性における進歩をもたらす（より低いことがより良好な親和性を意味する）・・・例示される実施形態においては，ＣＲ蛋白に対する。
結合親和性は約１×１０−９，１０−１０，１０−１１，１０−１２，１０−１３，１０−１４Ｍ以下である。本発明は種々の大きさ，例えば約１０３， ・ 約８５，・ ・， 約８２， ・・ ・，または５６アミノ酸長以下の環状ＲＡＰペプチドを提供する。一部の実施形態においては，共有結合は約７６，・・・，または５６アミノ酸の分だけ分離されたアミノ酸の間で形成される。
【００１７】本発明の環状ＲＡＰペプチドは成熟ヒトＲＡＰ配列に基づいたアミノ酸配列を含んでよい（配列番号９５）。１つの実施形態において，環状ＲＡＰペプ- 19 -チドのアミノ酸配列は成熟ＲＡＰのＮ末端から少なくとも２００から２４３個までのアミノ酸を消失している。即ち，環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰのアミノ酸１〜２００，・・・または１〜２４８を消失していてよい。関連する実施形態においては，ＲＡＰペプチドアミノ酸配列はさらに，成熟ＲＡＰのＣ末端から少なくとも４から１１個までのアミノ酸を更に消失している。即ち，環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰのアミノ酸３１４〜３２３・ ・または３１２〜３２３を消失していてよい。
・別の実施形態においては，ＲＡＰペプチドアミノ酸配列は（ａ）少なくとも７１アミノ酸長であり，そして（ｂ）アミノ酸２５６〜２７０を含む成熟ＲＡＰの連続部分を含む。関連する実施形態においては，ＲＡＰペプチドアミノ酸配列は（ａ）少なくとも７１アミノ酸長であり，そして（ｂ）アミノ酸２５６〜２７０を含む成熟ＲＡＰドメインの連続部分を含む。環状ＲＡＰペプチドのための基本を形成してよいＲＡＰの例示される部分は成熟ＲＡＰ（配列番号９５）のアミノ酸２００〜３２３，・・・または２４９〜３０３を包含する。
【００１８】本明細書に記載する通り，環状ＲＡＰペプチドはネイティブのＲＡＰのものと同様（例えばネイティブのＲＡＰと比較して約５倍差以下）のＣＲ含有蛋白に対する親和性および選択性を呈するものとして製造できる。環状ＲＡＰペプチドは又ネイティブのＲＡＰと比較してＣＲ含有蛋白１つ以上に対して向上した親和性および／または改変された選択性を呈するものとして製造できる。１つの実施形態において，環状ＲＡＰペプチドは少なくとも約１．５倍，２倍，２．５倍，３倍，４倍，５倍，７倍，１０倍，または２０倍の向上した親和性（ネイティブＲＡＰと相対比較して）および／またはＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０），ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７），ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２），ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４），ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４），ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６），ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７），ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１），ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４），ソルチリン関連受容体，ＳｏｒＬＡ（Ｑ９２６７３） ＬＲＰ１０， （Ｑ７Ｚ４Ｆ１） ＬＲＰ１１， （Ｑ８６ＶＺ４） ＬＲＰ１２， （Ｑ９Ｙ５６１），ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０），ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５），ＴＡＤ- 20 -Ｇ−１５（ＳＴ１４，Ｑ８ＷＶＣ１），ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７），ＴＭＰＳ４（Ｑ９ＮＲＳ４），ＴＭＰＳ６（Ｑ８ＩＵ８０），Ｑ６ＩＣＣ２，Ｑ６ＰＪ７２，Ｑ７６Ｂ６１，Ｑ７ＲＴＹ８，Ｑ７Ｚ７Ｋ９，Ｑ８６ＹＤ５，Ｑ８ＮＡＮ７，Ｑ８ＮＢＪ０，Ｑ８ＷＷ８８，Ｑ９６ＮＴ６，Ｑ９ＢＹＥ１，Ｑ９ＢＹＥ２，Ｑ９ＮＰＦ０およびｃｏｒｉｎ（Ｑ８ＩＺＲ７）よりなる群から選択されるＣＲ含有蛋白に対する進歩した結合選択性を呈する。同様の結合選択性は，例えば特定のＣＲ含有蛋白に対するペプチドの結合親和性の，少なくとも１つ他のＣＲ含有蛋白に対するペプチドの結合親和性と相対比較した場合の比により計算してよい。ペプチドは他のＣＲ含有蛋白１，２，３，４，５，６，７，または８つと相対比較した場合のＣＲ含有蛋白に対する結合選択性を呈してよい。
【００１９】本発明の環状ＲＡＰペプチドはネイティブのＲＡＰ配列を含んでよく，或いはネイティブの配列に対する変異を包含してよい。例示される実施形態においては，本発明の環状ＲＡＰペプチドは配列番号９７または配列番号９８の何れかと少なくとも６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては，環状ＲＡＰペプチドは約８５アミノ酸長未満であり，配列番号９８に少なくとも７０％同一である５０隣接アミノ酸を含み，そして約１×１０−８Ｍ以下の結合親和性ＫｄでＣＲ含有蛋白に結合する。一部の実施形態においては，環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰのアミノ酸２００〜３１９，３００〜３１９，または２４７〜２５７から選択される領域の何れか１つの内部の１，２，３，４，５，または６以上の位置において変異を包含する。
例示される実施形態においては，環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰ（配列番号９５）の１７５，２０５，２１３，２１７，２２６，２３０，２３２，２３９，２４１，２４２，２４６，２４７，２４９，２５０，２５１，２５６，２５７，２６１，２６６，２６７，２６８，２７０，２７３，２７９，２８０，２８７，２９０，２９４，２９６，２９７，２９８，３０５，３０８，３１１，３１２，３１３，３１４，- 21 -または３１５よりなる群から選択される１，２，３，４，５，または６以上の位置において変異を包含する。他の実施形態において，環状ＲＡＰペプチドは以下の位置，即ち：２０５，２１７，２４９，２５１，２５６，２５７，２６６，２７０，２９４，２９６，２９７，３０５の３つ以上において変異を含む。他の実施形態において，環状ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰの２５１，２５６および２７０位において少なくとも１つの変異を含有する。
【００２０】１つの特徴において，環状ＲＡＰペプチドはマトリプターゼ蛋白に選択的に結合する。マトリプターゼ特異的なペプチドは成熟ＲＡＰ（配列番号９５）のアミノ酸２４３〜３１３または２４９〜３０３を含んでよく，そして更に，成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２５７，２６６，２７０または２８０位の何れか１つにおいて変異を含有することを意図している。更に又，マトリプターゼ特異的ＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２５７，２６６，２７０および／または２８０位において少なくとも１，２，３，４，５または６つの変異を含有することを意図している。
【００２１】別の実施形態においては，環状ＲＡＰペプチドはＶＬＤＬＲ蛋白に選択的に結合する。ＶＬＤＬＲ特異的なペプチドは成熟ＲＡＰ（配列番号９５）のアミノ酸２４３〜３１３または２４９〜３０３を含んでよく，そして更に，ＲＡＰの２５１，２５６，２７０または２９６位の何れか１つにおいて変異を含有することを意図している。更に又，ＶＬＤＬＲ特異的なＲＡＰペプチドは成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２７０および／または２９６位において少なくとも１，２，３，または４つの変異を含有することを意図している。
【００２２】別の特徴において，環状ＲＡＰペプチドはＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０）蛋白に選択的に結合する。ＦＤＣ−８Ｄ６特異的ペプチドは成熟ＲＡＰ（配列番号９５）のアミノ酸２４３〜３１３または２４９〜３０３を含んでよく，そして更に，ＲＡＰの２５１，２５６，２７０，２７９または３０５位の何れか１つにおいて変異を含有することを意図している。更に又，ＦＤＣ−８Ｄ６特異的ＲＡＰ- 22 -ペプチドは成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２７０，２７９および／または３０５位において少なくとも１，２，３，４または５つの変異を含有することを意図している。
【００２４】上記した実施形態の何れかにおいて，ＲＡＰペプチドはペプチドのＮ末端またはその近傍におけるシステインおよびペプチドのＣ末端またはその近傍におけるシステインを含有してよく，これにより，２つのシステインの間のジスルフィド結合形成を介してペプチドの環化およびアルファヘリックスの安定化が可能となる。場合により，グリシンまたはプロリンがシステインおよびアルファヘリックスの間に介在してよい（例えばＮ末端におけるＣｙｓ−ＧｌｙおよびＣ末端におけるＧｌｙ−Ｃｙｓ）グリシンの導入は隣接する非ネイティブのヘリックス間のジ。
スルフィド結合に関するアルファヘリックスの切断を可能にする。
【発明を実施するための形態】【００３６】（発明の詳細な説明）ＲＡＰは機能的には２尖端性であり，第１および第３のドメイン（ｄ１およびｄ３）の両方が低ナノモル親和性においてＬＤＬＲ内の補体型リピート（ＣＲ）の縦列対に結合する。
約１１０アミノ酸よりなるドメイン３は該当するＣＲ対に対して最高の親和性を有することがわかっている。免疫原性を最小限とし，生産効率を最大限とし，そして力価を向上させるためには，受容体結合に直接参加するような配列にまでＲＡＰを最小限化することが有用である。しかしながら，ｄ３の安定な折り畳みは受容体接触表面の形成に直接参加しないＲＡＰ内の配列を必要とすることがわかっている。
ｄ３のＮ末端領域およびｄ２のＣ末端領域内に存在するこれらの追加的な配列は，従って，安定な折り畳みおよび高親和性受容体結合を確保するために必要である。
単離されたｄ３は完全長ＲＡＰの範囲内においてはｄ３ほど堅固には受容体に結合しない。折り畳み安定化配列を欠いているｄ３のトランケーションされた型も又，受容体への結合は不良である。ＲＡＰｄ３およびＬＤＬＲＣＲ３４の間の複合体から誘導された構造的データは，ＲＡＰｄ３の受容体結合配列は可撓性のループにより連結された概ね等しい長さの２つの逆平行アルファヘリックス内に存在すること- 23 -を示している。対となったヘリカルアンサンブルは強力な逆時計方向の捻転を有しており，そして伸長した捻転「Ｕ」に近似している。
【００３７】本発明は単一の分子内共有結合，例えばジスルフィド結合で安定化されたＲＡＰｄ３の実質的にトランケーションされた型を提供する。分子内共有結合を有さないトランケーションされた未環化の型は，ＬＲＰ１に対する低減した結合親和性を有する。これとは対照的に環状ＲＡＰペプチドは完全長ＲＡＰｄ３のものとは区別できない進歩した受容体結合親和性を有する。ネイティブＲＡＰ中に存在する大型のペプチド領域の代わりに単一の非ネイティブの共有結合を有するＲＡＰｄ３のフラグメント内の３次元のヘリカルな構造を安定化させる能力は，進歩した親和性を与え，そして多くの利点をもたらす。本発明は，例えば固相ペプチド合成により，組み換え生物を必要とすることなく小型ＲＡＰペプチドの迅速な製造を可能とし，潜在的に低減された免疫原性を可能とし，そして活性剤へのコンジュゲーションの多大な容易性を可能とする。
【００４６】「変異」という用語は本明細書においては，ペプチド配列におけるアミノ酸の挿入，欠失または置換を意味する。ネイティブまたは野生型のアミノ酸配列と相対比較して変異１個以上を有するペプチドは「類縁体」とみなされる。
【００４９】「ＣＲ含有蛋白」とはＣＲ１つ以上を含有する蛋白である。ＣＲ含有蛋白の非限定的な例はＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０），ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７），ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２），ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４），ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４），ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６），ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７），ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１），ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４），ソルチリン関連受容体，ＳｏｒＬＡ（Ｑ９２６７３），ＬＲＰ１０（Ｑ７Ｚ４Ｆ１），ＬＲＰ１１（Ｑ８６ＶＺ４），ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１），ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０），ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５），ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４／マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１，Ｑ８ＷＶＣ１），ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７） ＴＭＰＳ４， （Ｑ９ＮＲＳ４） ＴＭＰＳ６， （Ｑ８ＩＵ８０） Ｑ６ＩＣＣ２，，Ｑ６ＰＪ７２，Ｑ７６Ｂ６１，Ｑ７ＲＴＹ８，Ｑ７Ｚ７Ｋ９，Ｑ８６ＹＤ５，Ｑ８- 24 -ＮＡＮ７，Ｑ８ＮＢＪ０，Ｑ８ＷＷ８８，Ｑ９６ＮＴ６，Ｑ９ＢＹＥ１，Ｑ９ＢＹＥ２，Ｑ９ＮＰＦ０およびｃｏｒｉｎ（Ｑ８ＩＺＲ７）を包含する。これらの蛋白の各を識別するユニプロットアクセッション番号レファレンスを提示する。
【００６１】ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の２つ以上に言及する場合の「同一」または「パーセント同一性」という用語は後述する配列比較アルゴリズムの１つを用いて，または目視による検査により測定した場合に，最大一致となるように比較してアラインした場合に，同じであるか，または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する配列またはサブ配列の２つ以上を指す。・・・【０１５３】Ｅ．環状ＲＡＰペプチドを製造する方法ＲＡＰペプチドは好ましくは，当該分野で知られた何れかの方法を用いて形成できる共有結合の形成を介して環化する。一部の実施形態においては，共有結合はペプチドのＮ末端におけるアミノ酸とＣ末端におけるアミノ酸との間で形成される。・・・【０１５４】天然に環化するＲＡＰペプチドは，２つのシステインを所望の位置に挿入し，そしてシステインにジスルフィド結合を自然に形成させることにより，容易に作成できる。グリシンまたはプロリンをシステインに対して内部に（例えば最もＮ末端側のシステインに対してＣ末端側に，そして最もＣ末端側のシステインに対してＮ末端側に）挿入することによりＲＡＰペプチドのネイティブの３次元構造の共有結合による構造的ひずみを最小限にすることができる。
【０１５６】更に又，環状構造は，架橋形成基，ペプチドのアミノ酸残基の側鎖，またはペプチドの末端アミノ酸残基と形成することができる。・・・【０１５８】・・・Ｆ．ＲＡＰペプチドの製造ｉ．合成本発明のペプチドは従来の手法に従って溶液相固相，または液相のペプチド合成手法により合成できる。種々の自動合成装置が市販されており，そして既知のプロ- 25 -トコルに従って使用できる。・・・【０１６６】ｉｖ．細胞培養法キメラ蛋白コードＤＮＡまたはＲＮＡを含有する哺乳類細胞は，細胞の生育およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現のために適切である条件下に培養される。・・・【０１６８】ｖ．ＲＡＰペプチドの精製ＲＡＰペプチドは当該分野で良く知られている方法を用いながら逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製できる。・・・・【０２０１】（実施例１）ＲＡＰ変異体の形成および分析材料および方法・・・【０２０９】ＲＡＰファージディスプレイライブラリの製造−・・・【０２１２】ＲＡＰｄ３変異体ライブラリの製造−・・・【０２１５】ファージの製造−・・・【０２１６】ファージパニング−精製され，折り畳まれたＣＲ蛋白を用いて・・・９６穴プレートをコーティングした。 ・ファージライブラリをコーティングされた・ウェルに添加し，そして室温で２時間インキュベートした。次にウェルを・・・１５回洗浄した。結合したファージを・・・溶離させ，・・・回収した。レスキューされたファージは一夜（１６時間）３０℃で液体培地中細胞を生育せることにより増幅した。・・・【０２１７】ＲＡＰｄ３蛋白の発現−・・・【０２１８】変異体ＲＡＰｄ３の配列復帰および野生型ＲＡＰｄ３のフォワード変異−・・・【０２２３】固相結合試験−精製し，再折り畳みしたＣＲ蛋白（１μｇ）を・・・９６穴プレートに結合させた。
・・・次にＲＡＰリガンドを・・・固定化受容体と共にインキュベートした。
・・・ウェルを・・・洗浄し，そして結合したリガンドをポリクローナル抗ＲＡＰ・・・で検出した。
・・・ウェルを洗浄した後，二次抗体，Ｈ- 26 -ＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ・ ・と共にインキュベートした。
・ 洗浄後，ＴＭＢ基質溶液・ ・を添加してＨＲＰを検出した。
・ １ＮＨＣｌで発色を停止した。
マイクロプレート分光光度計・・・で４５０ｎｍにおける吸収を計測した。データをプロットし，単一部位結合と仮定して非直線回帰によりＫｄ値を誘導した・・・【０２２４】結果・・・【０２３１】ファージパニング系が親和性に基づいてＲＡＰ配列を単離するために使用できるかどうかを試験するために，野生型ＲＡＰを発現するファージのプリパレーションを，減衰したＣＲ対結合能力を有することが予測される（５５）変異体ＲＡＰ（Ｋ２５６Ｄ，Ｋ２７０Ｄ）を発現するファージのプリパレーション中に１０００倍希釈した。・・・【０２３２】ＲＡＰ配列がアフィニティー選択によりファージディスプレイライブラリから単離できると結論したことにより・・・。４クローンの第２のグループは２５６位および２７０位に同一の置換（Ｋ２５６Ａ，Ｋ２７０Ｒ）を有していたが，これらの２部位以外では多様な置換パターンを有していた。パニングの第５ラウンドの後，８無作為選択クローン中７つが以前に観察されたＶ１７５Ｌ，Ｓ２１３Ｔ，Ｅ２１７Ｋ，Ｈ２４９Ｙ，Ｅ２５１Ｋ，Ｋ２５６Ａ，Ｋ２７０Ｅの変異セットを有していた。この配列に関する全変異，即ち名称ＲＡＰｖ２ＡまたはＭｅｇａＲＡＰ１（配列番号９３）は，変異体ライブラリを作成するために特に変異誘発した領域にあった。
【０２３４】次に，ＲＡＰｄ３およびＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３蛋白のＬＲＰ１ＣＲ３−５およびＬＲＰ２ＣＲ８９への結合を試験した。親和性における相違への各ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３変異の相対的寄与度を理解するために，本発明者等は又，多くのＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３復帰変異株およびＲＡＰｄ３フォワード変異体を作成し，それらは全て，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３と野生型ＲＡＰｄ３の間の中間的な配列変異体を含んでいた（４アミノ酸Ｃ末端保持シグナルを欠失（配列番号９２）（図５Ａ）および５Ｂ，表２） …ＲＡＰｄ３は１６ｎＭの解離定数でＬＲＰ１ＣＲ３−５に結。
- 27 -合し，ＬＲＰ２ＣＲ８９に対する有意な親和性は示さず，図４に示したデータに合致していた。逆にＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３は見かけの解離定数３８ｎＭでＬＲＰ２ＣＲ８９に結合したが，ＬＲＰ１ＣＲ３−５には有意な親和性を有していなかった。
従って，野生型ＲＡＰｄ３およびＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３はこれらの２つの受容体フラグメントに対して反転した結合優先性を有している。２つのＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３復帰変異体であるＴ２１３ＳおよびＫ２１７ＥはＬＲＰ２ＣＲ８９に対して僅かに向上した親和性を有しており，そしてＬＲＰ１ＣＲ３−５に検出可能に結合することは不可能なままであった。３つのＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３復帰変異体，Ｙ２４９Ｈ，Ｋ２５１ＥおよびＡ２５６Ｋは何れの受容体フラグメントにも結合できず，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３とＬＲＰ２ＣＲ８９との間の相互作用のために変異が重要であり，そしてＬＲＰ１ＣＲ３−５への結合の途絶を個別に担っているわけではないことを示していた。興味深いことに，Ｅ２７０Ｋ復帰変異体はＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３よりも高い親和性で両方の受容体フラグメントに結合し，ＬＲＰ２ＣＲ８９に対しては８ｎＭ，そしてＬＲＰ１ＣＲ３−５に対しては１４２ｎＭの見かけの解離定数を示していた。ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３変異体はＬＲＰ２ＣＲ８９に対する親和性に基づいて選択されているため，この結果はすべての可能な配列変異体を説明するには不十分である出発ライブラリの多様性と合致している。或いは，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３とＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３Ｅ２７０Ｋとの間の親和性の相違は反復パニングにおいて後者を優勢とするには不十分である場合がある。二重復帰変異体Ｔ２１３Ｓ，Ｅ２７０Ｋは本発明者等の試験においてはＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３とは区別不可能であった結合挙動を有していた。これらの位置における２つの単一部位復帰変異体はＬＲＰ２ＣＲ８９に対して，そしてＥ２７０Ｋの場合はＬＲＰ１ＣＲ３−５に対しても向上した親和性を示すように観察されたため，この結果はこれらの復帰変異体に起因する結合作用に関する加法性の欠如，または，本発明者等の試験におけるこの親和性の範囲内における正確さの欠如を示している。Ｋ２５１Ｅ，Ｅ２７０Ｋ二重復帰変異体の結合挙動はＥ２５１Ｋ変異に対するＬＲＰ２ＣＲ８９へのＭｅｇａ- 28 -ＲＡＰ１ｄ３の親和性の強力な依存性を示唆している。この復帰変異体と単一部位Ｅ２７０Ｋ復帰変異体との間のＬＲＰ２ＣＲ８９の親和性における相違はほぼ２０倍である。Ａ２５６Ｋ，Ｅ２７０Ｋ二重復帰変異体はＬＲＰ２ＣＲ８９への親和性の２倍の損失をもたらし，このフラグメントへの親和性に対してＫ２５６ＡＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３変異が有している中等度の正の作用を示唆している。しかしながら，この二重復帰変異体とＥ２７０Ｋ単一部位復帰変異体との間の最も顕著な相違はＬＲＰ１ＣＲ３−５への親和性におけるほぼ３０倍の向上である。従って，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３におけるＫ２５６Ａの変異は２つの受容体フラグメントの間で区別するこの変異体の能力の重要な決定要因であり，ＬＲＰ２ＣＲ８９への親和性も同時に向上させつつＬＲＰ１ＣＲ３−５への親和性に負の影響を与えることによりその作用を発揮している。
【０２３７】スクリーニング法の一般性の試験として，ファージライブラリパニング実験を別のＣＲ蛋白に対して実施した。単離した変異体の配列は表４および図８に示す通りである。先ず，ＲＡＰｄ３単独の変異体をコードするファージディスプレイライブラリを用いたパニングのための基質として，ヒトＶＬＤＬＲの最後の３つのＣＲドメインを構成するＶＬＤＬＲＣＲ６−８を使用した。パニング５ラウンドの後，８無作為選択クローン中５つが同じ変異セット，即ち：Ｒ２０５Ｓ，Ｅ２５１Ｒ，Ｋ２５６Ｌ，Ｋ２７０Ｅ，Ｒ２９６Ｌ，Ｇ３１３Ｄを有していた。この配列変異体，ＶＲＡＰ１）ｄ３を固相結合試験のために発現させた。ＶＲＡＰ１ｄ３，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３およびＲＡＰｄ３のＬＲＰ１ＣＲ３−５，ＬＲＰ２ＣＲ８９およびＶＬＤＬＲＣＲ６−８への結合を比較した。同様の変異体配列，Ｅ２５１Ｔ，Ｋ２５６Ｉ，Ｋ２７０Ｅ，Ｒ２９６ＬをＶＬＤＬＲＣＲ７８上で選択した。
本発明者等は又，同じｄ３ライブラリを用いながらヒトマトリプターゼ由来の３つのＣＲ対，ＭＡＴＣＲ１２，ＭＡＴＣＲ２３およびＭＡＴＣＲ３４上でパニングを行った。マトリプターゼ対に対するパニングの第６ラウンドによりファージライブラリを主要な配列に分割した。ＭＡＴＣＲ２３上で選択した主要な配列はＥ２５１- 29 -Ｇ，Ｋ２５６Ｒ，Ｋ２７０Ｗであった。この変異体をＭａｔＲＡＰ１（ＲＡＰｖＭＡ）と命名した。ＭＡＴＣＲ３４上で選択した主要な配列はＳ２３２Ｐ，Ｅ２３９Ｇ，Ｅ２４６Ｇ，Ｅ２５１Ｌ，Ｋ２５６Ｐ，Ｉ２６６Ｔ，Ａ２６７Ｖ，Ｈ２６８Ｒ，Ｋ２７０Ｐ，Ｈ２７３Ｙ，Ｒ２８７Ｈ，Ｈ２９０Ｙ，Ｋ２９８Ｒ，Ｓ３１２Ｆであった。この変異体をＭａｔＲＡＰ２（ＲＡＰｖＭＢ）と命名した。パニング実験は又ＦＤＣ−８Ｄ６抗原由来のＣＲ対に対しても実施した。選択した主要な変異体はＫ２５６Ｓ，Ｋ２７０Ｓ，Ｌ２７１Ｍ，Ｄ２７９Ｙ，Ｖ２８３Ｍ，Ｋ３０５Ｔ，Ｋ３０６Ｍであった。この変異体を３２０ＲＡＰ１と命名した。
【０２３８】ＲＡＰｄ３配列変異体の長さを最小限化できる程度を試験するために，ＭａｔＲＡＰ１の逐次的にトランケーションされた切片をＰＣＲにより作成し，発現させ，精製し，そして上記した通り結合に関して試験した（図９）・・・最良。
のトランケーションされた変異体はアミノ酸２４３〜３１３（７１アミノ酸）よりなるものであった。親和性の向上におけるこの修飾の一般性を試験するために，本発明者等は３２０ＲＡＰ１に対して同一のトランケーションを作成した。この変異体の得られたトランケーションされた型は完全長変異体と比較してＦＤＣ−８Ｄ６抗原対に対する親和性において３．５倍の向上で結合した・・・。
【０２３９】ＶＬＤＬＲＣＲ７８へのＶＲＡＰ１ｄ３（判決注：ＶＲＡＰ２ｄ３の誤記。の結合に関する見かけの解離定数は４４±９ｎＭであることが測定された。
）次に本発明者等はＬＲＰ１ＣＲ３−５，ＬＲＰ２ＣＲ８９，ＬＲＰ２ＣＲ２７２８，ＬＲＰ２ＣＲ３０３１，ＬＲＰ２ＣＲ３４−３６，ＬＲＰ２ＣＲ３５３６，ＶＬＤＬＲＣＲ７８，ＶＬＤＬＲＣＲ６−８，ＬＲＰ６ＣＲ１−３，ＬＲＰ６ＣＲ１２，ＬＲＰ６ＣＲ２３，ＭＡＴＣＲ１２，ＭＡＴＣＲ２３およびＭＡＴＣＲ３４を包含する１４のＣＲ対またはトリプレットへの，各々８０ｎＭの濃度における，ＲＡＰｄ３，ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３，ＶＲＡＰ１ｄ３，ＭａｔＲＡＰ１ｄ３およびＭａｔＲＡＰ２ｄ３の結合を比較した（図７）。前回と同様，ＲＡＰｄ３はＬＲＰ１ＣＲ３−５に結合するのみであった。ＭｅｇａＲＡＰ１ｄ３はＬＲＰ２ＣＲ８９のみに結- 30 -合した。ＶＲＡＰ１ｄ３はＣＲ７８対を包含するトリプレットであるＶＬＤＬＲＣＲ７８およびＶＬＤＬＲＣＲ６−８の両方に結合した。ＭａｔＲＡＰ１およびＭａｔＲＡＰ２はＭＡＴＣＲ１２およびＭＡＴＣＲ２３の両方に結合したが，他のＣＲ対にはその傾向は小さかった。
【０２４０】ＣＲ対およびトリプレット上のパニングに加えて，全体のＣＲ対含有ヒト蛋白をＲＡＰｄ３変異体ファージパニング操作法のための標的として使用した。これらの市販の蛋白はｃｏｒｉｎ，ＬＲＰ６，ＦＤＣ−８Ｄ６抗原および補体因子Ｉを包含していた。パニングは単離されたＣＲ対およびトリプレットに関して記載したものと全く同様に実施した。
【０２５３】（実施例３）環状ＲＡＰペプチドの製造および特性化環状ＲＡＰペプチドを以下の通り製造し，そして結合親和性に関して特性化した。・・・【０２５４】固相結合試験は以下の通り実施した。・・・【０２５５】 ・・ ・ｍＲＡＰｃ（配列番号９９）の最小化型を作成するために， ・・・これらの置換はＡ２４２ＧおよびＲ３１４Ｇである。これらの部位におけるグリシンの導入は隣接する非ネイティブのヘリックス間のジスルフィド結合のためにヘリックス内に中断部をもたらすことを意図していた。次に２つのシステインをそれぞれヘリックス１および２におけるＧ２４２およびＧ３１４の前および後で置換することにより，ジスルフィド結合の形成を可能にした。これらの置換はＥ２４１ＣおよびＩ３１５Ｃであった。ヘリックス２のＣ３１５に対してＣ末端側にはそれ以外の残基は包含させなかった。
・・・ペプチドは固相合成中に分子内ジスルフィド結合形成により環化させた。ｍＲＡＰｃペプチドの線状化対照であるｍＲＡＰを得るために，両方のシステインをセリンで置換した。ｍＲＡＰｃの別の対照として，変異Ｋ２５６ＡおよびＫ２７０Ｅを有する以外は同一のペプチド，即ちｍＲＡＰｃｋｏを作成した。これらの変異はＬＲＰ１に対するＲＡＰｄ３の親和性を有意に低下さ- 31 -せることが予めわかっている。
【０２５７】ｍＲＡＰ（配列番号１０７）およびｍＲＡＰｃｋｏはｈｒＬＲＰ１クラスターＩＩに対する計測可能な親和性を有していなかったが，ｍＲＡＰｃは１０±２ｎＭのＫｄでカルシウム依存的な態様において高親和性で結合した。この結合親和性はこの系においては完全長のＲＡＰｄ３のものとは差がなかった（８±１ｎＭ） 更に又，。 マウスＶＬＤＬＲの全エクトドメインへのペプチドの結合も計測した。結合親和性はやはり同等であり，解離定数はｍＲＡＰｃでは５±１ｎＭであり，そして完全長ＲＡＰｄ３では１±０．２であった。
【０２５８】（実施例４）別の環状ＲＡＰペプチドの特性化別の環状ＲＡＰペプチドを上記した通り開発し，そしてＬＲＰ１受容体に結合するその能力を試験した。
【０２５９】ｍＲＡＰ−８ｃペプチドを形成するために，アミノ酸２４６〜３１２のトランケーションされたＲＡＰペプチド配列を利用し，そして以下のアミノ酸置換，即ち：Ｅ２４６Ｃ，Ｌ２４７ＧおよびＬ３１１ＧおよびＳ３１２Ｃを作成した。ｍＲＡＰ−８ｃペプチドは配列番号１００に示す通りである。別のトランケーションされたペプチドｍＲＡＰ−１４ｃを作成するために，２５０位で始まり３０９位で終わるトランケーションされたＲＡＰを使用した。以下のアミノ酸置換，即ち：Ｆ２５０ＣおよびＬ３０８ＧおよびＱ３０９ＣをｍＲＡＰ−１４ｃに対して行った。ヘリックス１に由来するＦ２５０Ｃ側鎖は複合体の構造におけるヘリックス２において既に直接位置付けられているため，ｍＲＡＰ−１４ｃの場合にはシステインの後にグリシンを置換させなかった。ｍＲＡＰ−１４ｃの配列を配列番号１０１に示す。別のトランケーションされた環化ペプチドであるヘプタイドを開発した。
ヘプタイドの配列はＲＡＰのアミノ酸２４６〜３１３から誘導した。以下のアミノ酸置換，即ち：Ｅ２４６Ｃ，Ｌ２４７Ｇ，Ｇ２８０Ａ，Ｌ３１１Ａ，およびＳ３１２Ｃを行うことによりヘプタイドを形成した。ヘプタイドの配列を配列番号１０３- 32 -に示す。
【０２６０】ＬＲＰ１およびＶＬＤＬＲ受容体へのｍＲＡＰ−８ｃおよびｍＲＡＰ−１４ｃペプチドの結合は上記した通り評価した。ｍＲＡＰ−８ｃは約４〜６ｎＭの親和性（２つの別個の試験）でＬＲＰ１（クラスターＩＩ）受容体に結合したのに対し，ｍＲＡＰ−１４ｃは約２１ｎＭの親和性で結合した。ヘプタイド環状ペプチドは約３．５ｎＭの親和性でＬＲＰ１に結合した。
【０２６１】これらの結果は数種の異なる環状ＲＡＰペプチドが高親和性でＬＲＰ１受容体に結合できることを示している。
【図５−３】- 33 -【図６−３】【図７】- 34 -【図８】【図９】(2) 前記(1)によれば,請求項１及び本願明細書には，本願発明に関し，次のような開示があると認められる。
本願発明は，低密度リポ蛋白受容体関連蛋白（ＲＡＰ）の環状ペプチド及びその- 35 -類縁体に関する（【０００２】。
）ＣＲ含有蛋白は，特徴的な折り畳み構造である「補体型リピート（ＣＲ）」を含む蛋白であり，低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体ファミリー，II 型膜貫通セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ）ファミリー，ＦＤＣ−８Ｄ６抗原（ＣＤ３２０）などの多数のメンバーを包含するものであるところ，その病態生理学的プロセスにおける重要な役割のため，有用な薬物標的とされている（【０００６】【０００９】【０， ，０１４】及び【００４９】。
）他方，ＲＡＰは，ＬＤＬ受容体ファミリーを含めたＣＲ含有蛋白の多くに結合する蛋白であり，ＲＡＰを構成する３つの弱い相同性を有するドメイン（ｄ１，ｄ２及びｄ３）のうちｄ３が最高の親和性でＣＲ含有蛋白に結合する。これまで，ＲＡＰのトランケーション（短縮型）及び／又は変異された型の結合特性について研究が行われている。なお，成熟ＲＡＰは３２３個のアミノ酸からなり（配列番号９５），アミノ酸２０１〜３２３（配列番号９６）がｄ３に相当し，ｄ３のうちアミノ酸２４３〜３１３が配列番号９７（７１アミノ酸長）である（【０００３】〜【０００５】及び【００１４】。
）従来，特定のＣＲ含有蛋白に対して，選択的に作用する薬物を開発する手段を提供するために（【０００９】，ＲＡＰ本来の結合特性を保持しているか，又は特定の）ＣＲ含有蛋白に対して進歩した結合選択性を有し，かつ，他の所望の特性，例えば，進歩した安定性又は生産製造の容易さを呈するＲＡＰフラグメント及び変異体の必要性が存在していた（【００１１】。
）そこで，本願発明は，高い結合親和性でＣＲ含有蛋白に結合する環状ＲＡＰペプチドを提供することを課題としたものであり，その解決手段として，「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含み，８５アミノ酸長以下である環状ＲＡＰペプチド」であって，請求項１に記載された３４個の選択肢を有する群から選択されるＣＲ含有蛋白に１×１０ −８ Ｍ以下の結合親和性Ｋｄで結合する環状ＲＡＰペプチドの構成を採用するものである（請求項１，００１９】。
【 ）- 36 -そして，本願発明に係る環状ＲＡＰぺプチドは，所望の特性，例えば，ＣＲ含有蛋白に対する進歩した結合親和性，結合選択性，安定性，及び／又は製造の容易さを示す場合がある。また，本願発明に係る環状ＲＡＰペプチドを，診断薬又は治療薬とコンジュゲートすることにより，ＣＲ含有蛋白を発現する組織への診断薬又は治療薬のターゲティング送達のために用いることができる（【００１５】。
）例えば，マトリプターゼ蛋白に選択的に結合する環状ＲＡＰペプチドは，成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２５７，２６６，２７０又は２８０位において１〜６の変異を含有し 【００２０】，（ ） ＶＬＤＬＲ蛋白に選択的に結合する環状ＲＡＰペプチドは，成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２７０又は２９６位において１〜４の変異を含有し【００２１】，（ ）ＦＤＣ−８Ｄ６蛋白に選択的に結合する環状ＲＡＰペプチドは，成熟ＲＡＰの２５１，２５６，２７０，２７９又は３０５位において１〜５の変異を含有する（【００２２】。
）２ 取消事由１（過度の試行錯誤が不要であること）について(1)ア 原告は，技術常識である「ＲＡＰペプチドの受容体結合に関与ないし影響を与えるアミノ酸残基」を変異させれば，容易に結合親和性の高いペプチドが得られるから，そのようなペプチドを製造し，その機能性の確認を行うためには過度な試行錯誤を要しない，と主張する。
イ 甲１８〜２１には，以下の記載がある。
(ｱ) 甲１８（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY ，Vol.276, No.31）「短縮型ＲＡＰタンパク質からの我々の発見に基づき，我々は，変異解析のために３つの配列モチーフ，Ｒ ２０３ ＬＲ ２０５ Ｒ ２０６（部位Ａ），Ｒ ２８２ ＶＳＲ ２８５ ＳＲ ２８７ ＥＫ ２８９（部位Ｂ），およびＲ ３１４ ＩＳＲ ３１７ ＡＲ ３１９（部位Ｃ）を選択した。」（２９３４２頁右欄６〜９行）「ＲＡＰ内の塩基性集合変異の効果は，ＬＲＰ結合活性に対して，ヘパリン結合活性と同様の傾向を示すが，それらは一般的に規模についてより厳格であった。・・・ヘパリンへのように，ＲＡＰ内の部位Ｂでの変異の全体的な効果は，- 37 -そのＬＲＰ結合活性を最も減少させるようであった」（２９３４２頁右欄３４〜４５行）また，表 II（２９３４１頁）には，ＲＡＰ内の「Ｒ ２８２ ＶＳＲ ２８５ ＳＲ ２８７ ＥＫ ２８９ 」のＬＲＰ結合への寄与が「＋＋＋＋」であることが記載されている。
(ｲ) 甲１９（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.278, No.20）「これらの目的は，ＲＡＰのランダム変異によって達成され，これにより，ＲＡＰのカルボキシル末端ドメインとＬＲＰおよびヘパリンとの結合に必要である，カルボキシル末端ドメイン内にある２つの重大なリシン残基，リシン２５６およびリシン２７０が同定された。これらの２つのリシン残基のいずれかが変異したＲＡＰ分子は，それでもＬＲＰに結合するが，アフィニテイは減少していた。」（１７９８６頁左欄１６〜２３行）(ｳ) 甲２０（Molecular Cell 22）「ＲＡＰのドメイン２（Ｄ２；残基１０１−２１６）および３（Ｄ３；２０６−３２３）」（４２５頁左欄表１）「Ｄ３内の保存されたヒスチジンは，ＲＡＰのＬＲＰへの結合に貢献することを示す。」（４２５頁右欄１８〜１９行）「我々は，いずれの保存されたヒスチジン部位での単一の変異単独では，ＲＡＰのＬＲＰへの結合を変化させないことを見出し，これはヒスチジン残基に起因するｐＨ依存性は，本質的に集合的なものであることを示唆していた。」（４２６頁左欄１３〜１６行）(ｴ) 甲２１（米国特許第 8,236,753 B2 号）「いくつかの実施形態において，少なくとも１つのＲＡＰドメイン中のヒスチジン残基の少なくとも１つ（例えば，１つ，２つ，３つ，４つ）は，疎水性残基，中性残基またはフェニルアラニンに置換される。・・・いくつかの実施形態において，ヒスチジン２５７またはヒスチジン２５９またはヒスチジン２６８またはヒスチジン２９０はフェニルアラニンに置換される。」（２欄２５〜２８，３２- 38 -〜３４行）「我々は次にＲＡＰ−Ｄ３の耐酸性形態および熱耐性形態は，ＬＤＬＲのＬＡ３−４モジュールペアを構成するポリペプチドとなお結合することを，それぞれのＲＡＰタンパク質のＬＤＬＲについての結合アフィニティを中性ｐＨで等温滴定型カロリメトリーによって測定することによって確かめた（図３および表１）。・・・低塩濃度（５０ｍＭ ＮａＣｌ）で，野生型ＲＡＰ−Ｄ３とＬＡ３−４について測定される解離定数は４８０±４０ｎＭであり，１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度では，値は１．２±０．１マイクロＭに上がる。ＲＡＰ−Ｄ３の３つのフェニルアラニン変異について，アフィニティは８５０±１６０ｎＭ（Ｈ２５７Ｆ／Ｈ２５９Ｆ；５０ｍＭ ＮａＣｌ），１．２±０．３ｎＭ（判決注：表１の記載からすれば，「ｎＭ」ではなく，「μＭ」の誤記。）（Ｈ２６９Ｆ（判決注：Ｈ２６８Ｆの誤記）／Ｈ２９０Ｆ；５０ｍＭ ＮａＣｌ）および８５０±１６０ｎＭ（ＲＡＰ＿Ｄ３−ｑｕａｄ；技術的な理由のため，この滴定のためには,１００ｍＭのＮａＣｌ濃度が必要である）。」（２９欄５０〜６７行）ウ 上記甲１８〜２１の記載によれば，原告主張のとおり，ＲＡＰにおける「２８２〜２８９」（甲１８），「２５６，２７０」（甲１９），「２５７，２５９，２６８，２９０のヒスチジン残基」（甲２０，２１）などのアミノ酸残基が，ＲＡＰペプチドとＬＲＰやＬＤＬＲなどのＣＲ含有蛋白との結合に関与ないし影響与えることが理解できる。しかし，これらのアミノ酸残基を変異させた場合に，ＣＲ含有蛋白への結合親和性が向上することは記載されておらず，むしろ低下すること（甲１８，１９，２１）が記載されている。
そうすると，原告が主張するように，ＲＡＰペプチドの受容体結合に関与ないし影響を与えるアミノ酸残基がどこかということが技術常識であったとしても，そのアミノ酸残基を変異させた場合に，特定のＣＲ含有蛋白との結合親和性の高いペプチドが得られるとは限らないから，当該ペプチドを得ることが容易であるとは認められない。
- 39 -したがって，原告の上記主張には，理由がない。
(2)ア 原告は，請求項３５には，変異導入が可能な３０以上のアミノ酸残基の位置が記載され，本願明細書の【００２０】，【００２１】，【０２０１】（実施例１）及び表４には，特定のＣＲ含有蛋白に結合特異性をもたらす残基が記載されているから，当業者は，過度の試行錯誤をすることなく，本願発明のペプチドを合成して，ＣＲ含有蛋白との結合親和性について容易に試験することができる，と主張する。
イ しかし，上記(1)のとおり，ＲＡＰペプチドの受容体結合に関与ないし影響を与えるアミノ酸残基を変異させれば，容易に結合親和性の高いペプチドが得られるとは認められない。また，上記１(2)のとおり，【００２０】〜【００２２】では，特定のＣＲ含有蛋白に結合特異性をもたらすアミノ酸残基の変異位置が開示されているが，アミノ酸残基の変異位置と結合親和性との関係については記載されておらず，特定のアミノ酸残基を変異させた場合に結合特異性があるからといって，当該残基からなるペプチドの結合親和性が本願発明の要件を満たすか否かは別の問題であり，この点については，別途，試験によって調査する必要がある。
ウ さらに，実施例１には，ファージパニング法を用い，ＲＡＰｄ３の多数の未環化の変異体を製造し，そのＣＲ含有蛋白に対するＫｄ値を測定して，短縮型変異体やアミノ酸を置換した変異体によって，ＣＲ含有蛋白に対するＫｄ値や選択性がどう変化するかを調べた結果が記載されている。しかし，以下のとおり，これを参照しても，「８５アミノ酸長以下である環状」のペプチドが，「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含」んでいれば，所定のＫｄ値を満たすことを裏付けているとはいえない。
すなわち，実施例１では，ＲＡＰｄ３，並びに，ＭｅｇａＲＡＰ１，ＶＲＡＰ２，ＭａｔＲＡＰ１，ＭａｔＲＡＰ２及び３２０ＲＡＰ１という５つのＲＡＰｄ３変異体（ＲＡＰｄ３の２４９，２５１，２５６，２５７，２６６，２７０，２７９，２- 40 -８０，２９６及び３０５のいずれかの位置に４〜５個のアミノ酸置換を有するもの），あるいは，ＲＡＰｄ３とＭｅｇａＲＡＰ１の中間の変異を有する各種の変異体（２１３，２１７，２４９，２５１，２５６，２７０に１〜５個のアミノ酸置換を有するもの）を製造し，いくつかのＣＲ含有蛋白に対するＫｄ値などを測定している 【図（５−３】表２，【図６−３】表４，【図７】【図８】。これらの変異体は，請求項３， ）５に例示された位置にアミノ酸変異を有するものであるが，変異前に比べて結合親和性が向上しＫｄ値が１×１０−８Ｍ（１０ｎＭ）より小さくなる場合があるものの（例えば，ＲＡＰｄ３ Ｅ２１７Ｋ，ＲＡＰｄ３ Ｅ２５１Ｋ 【図５−３】（ 表２），）ＣＲ含有蛋白に対して結合親和性がないものや，Ｋｄ値が１×１０ -８Ｍを超えるものが多いことが示されている。
また，ＲＡＰｄ３とその変異体は，ＣＲ含有蛋白の種類によって結合親和性が顕著に異なることが示されている（【図７】【図５−３】表２）， 。
さらに，ＭａｔＲＡＰ１は，その短縮型変異体によってＣＲ含有蛋白に対する結合親和性が変化することから，アミノ酸長（配列番号９７のどの範囲のアミノ酸配列を含むのか。）も結合親和性に影響することが示されている（【図９】。
）そうすると，実施例１の未環化ＲＡＰペプチドに関する多数の実験結果を参照することにより当業者が理解できることは，本願明細書に例示されたアミノ酸変異位置であっても，具体的なアミノ酸変異位置やアミノ酸長（配列番号９７のどの範囲のアミノ酸を含むのか。 によって，） ＣＲ含有蛋白に対するＫｄ値が低くなり結合親和性が高くなることもあれば，逆に，Ｋｄ値が高くなり結合親和性が低くなったり，更には結合親和性がなくなることもあり，加えて，ＣＲ含有蛋白の種類によってもＫｄ値が顕著に異なることがある。
また，下記２に実施例３及び４について述べるとおり，未環化ＲＡＰペプチド（ｍＲＡＰ）がＣＲ含有蛋白に結合親和性がなくても，その両末端をシステインに置換して環化したもの（ｍＲＡＰｃ）は所定のＫｄ値を満たす場合があるから，実施例１における多数の変異体におけるアミノ酸配列とそのＫｄ値との関係が，そのまま- 41 -環状ＲＡＰぺプチドにも応用できると推認することは困難である。
(3) 原告は，本願明細書に記載されたファージディスプレイ技術及びＰＣＲによるランダム変異誘発を用いるランダム変異誘発スクリーニングを用いた本願発明に係るペプチドの製造は，開発業務受託機関を利用することもできるから，当業者にとって負担となるものではない，と主張する。
しかし，本願明細書には，変異導入が可能なアミノ酸残基の位置が記載されていることを考慮しても，本願発明は，「５０個の連続するアミノ酸」のうち最大１５個（５０個×３０％）のアミノ酸の変異までが許容されるものであり，変異の種類には，挿入，欠失又は置換がある（【００４６】）から，なお，これらの条件を満たすアミノ酸配列は，極めて多数に及ぶものである。そうすると，多数のペプチドを製造してスクリーニングする方法が確立されており，開発業務受託機関に委託して時間や手間を短縮することができるとしても，そのような実験を膨大な回数繰り返して，本願発明に含まれる環状ＲＡＰペプチドを製造することは，当業者にとって過度な試行錯誤を要するといわざるを得ない。
よって，原告の主張には，理由がない。
３ 取消事由２（実施例が十分であること）について(1) 原告は，本願発明の「５０個の連続するアミノ酸」からなるアミノ酸配列との同一性を比較するアミノ酸配列が, ７１個のアミノ酸からなる配列番号９７の「全長」であるとの解釈を前提として，本願明細書には，@５残基よりも多くの残基を変異させたＲＡＰ改変体が記載されている，A配列番号９７の７１残基に対して５７残基が同一であるペプチド（ｍＲＡＰ−１４ｃ），すなわち，８０％の同一性を示すペプチドが具体的に記載されている，と主張し，その根拠として，１１アミノ酸残基短く，３つの置換変異を含んだｍＲＡＰ−１４ｃの全長（６０アミノ酸長）と，「７１個のアミノ酸からなる配列番号９７の全長」とを比較し，ｍＲＡＰ−１４ｃは配列番号９７のアミノ酸配列と８０％同一であると計算する。
しかし，配列番号９７のアミノ酸配列と比較するアミノ酸配列は，本願発明の請- 42 -求項１の文言からは，「５０個の連続するアミノ酸」としか特定されないから，ｍＲＡＰ−１４ｃの全長とすることはできない。
また，上記１(1)のとおり，本願明細書【００６１】には，「パーセント同一性」という用語は，２つのアミノ酸配列を最大一致となるように比較してアラインした場合に，同じであるアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する配列又はサブ配列の２つ以上を指す，と記載されているから，「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含む」とは，環状ＲＡＰペプチドにおける「５０個の連続するアミノ酸」が配列番号９７における「対応する配列」と比較して少なくとも７０％同一であることを意味しているといえる。
そうすると，原告の上記主張の前提となるパーセント同一の解釈は誤っており，原告の主張はその前提を欠くから，失当である。
(2)ア 原告は，本願明細書には，本願発明に係るペプチド製造についての実施例３及び４，並びに図９にＲＡＰペプチド短縮型が結合親和性を増加させることが記載されているから，本願発明は実施可能要件を満たす，と主張する。
イ 本願明細書の実施例３及び４において，ｍＲＡＰｃ，ｍＲＡＰｃｋｏ，ｍＲＡＰ−８ｃ，ｍＲＡＰ−１４ｃ及びヘプタイドの５つの環状ペプチドが製造されている。
ｍＲＡＰｃ（配列番号９９，甲１「配列表」３８頁）は，成熟ＲＡＰペプチドの２４１，２４２，３１４及び３１５の位置に，環化のためのシステインの導入を含めたアミノ酸置換を行った（合計４個）もので，７５アミノ酸長の環状ペプチドである（【０２５５】。ｍＲＡＰｃは，配列番号９７と１００％同一である５０個の連）続するアミノ酸を含む。
ｍＲＡＰｃｋｏは，成熟ＲＡＰペプチドの２４１，２４２，２５６，２７０，３１４及び３１５の位置に，環化のためのシステインの導入を含めたアミノ酸置換を行った（合計６個）もので，７５アミノ酸長の環状ペプチドである（【０２５５】。
）ｍＲＡＰｃｋｏは，配列番号９７と９８％同一である５０個の連続するアミノ酸を- 43 -含むものである。
ｍＲＡＰ−８ｃ（配列番号１００，甲１「配列表」３８頁）は，成熟ＲＡＰペプチドの２４６，２４７，３１１及び３１２の位置に，環化のためのシステインの導入を含めたアミノ酸置換を行った（合計４個）もので，６７アミノ酸長の環状ペプチドである（【０２５９】。ｍＲＡＰ−８ｃは，配列番号９７と１００％同一である）５０個の連続するアミノ酸を含むものである。
ｍＲＡＰ−１４ｃ（配列番号１０１，甲１「配列表」３９頁）は，成熟ＲＡＰペプチドの２５０，３０８及び３０９の位置に，環化のためのシステインの導入を含めたアミノ酸置換を行った（合計３個）もので，６０アミノ酸長の環状ペプチドである（【０２５９】。ｍＲＡＰ−１４ｃは，配列番号９７と１００％同一である５０）個の連続するアミノ酸を含むものである。
ヘプタイド（配列番号１０３，甲１「配列表」４０頁）は，成熟ＲＡＰペプチドの２４６，２４７，２８０，３１１及び３１２の位置に，環化のためのシステインの導入を含めたアミノ酸置換を行った（合計５個）もので，６８アミノ酸長の環状ペプチドである（【０２５９】。ヘプタイドは，配列番号９７と９８％同一である５）０個の連続するアミノ酸を含むものである。
このうち，ｈｒＬＲＰ１クラスターII 又はマウスＶＬＤＬＲに対するＫｄ値が１×１０−８Ｍ以下であることが確認され，本願発明の所定のＫｄ値を満たすと認められるものは，ｍＲＡＰｃ，ｍＲＡＰ−８ｃ及びヘプタイドの３つである 【０２５７】（ ，【０２６０】。また，ｍＲＡＰｃの線状化（未環化）対照であるｍＲＡＰは，ｈｒ）ＬＲＰ１クラスターII に結合親和性を有していないが，環化により，ＣＲ含有蛋白に対する結合親和性が向上することが示されている（【０２５７】。
）他方，ｍＲＡＰｃｋｏは，ｍＲＡＰｃの２５６と２７０のアミノ酸を置換したペプチドで，ｈｒＬＲＰ１クラスターII に対する結合親和性を有しておらず（【０２５７】，また，ｍＲＡＰ−１４ｃ（６０アミノ酸長）は，本願発明の所定のＫｄ値）を満たす上記３つのぺプチド（ｍＲＡＰｃ，ｍＲＡＰ−８ｃ及びヘプタイド。６７- 44 -〜７５アミノ酸長）よりも若干短いペプチドで，ｈｒＬＲＰ１クラスターII に対するＫｄ値が２１ｎＭ（２．１×１０−８Ｍ）であり，本願発明の所定のＫｄ値を満たさないものであった（【０２６０】。
）そうすると，実施例３及び４の記載から，ＣＲ含有蛋白に結合親和性を有しない未環化ＲＡＰペプチドを環化させると，所定のＫｄ値を満たす場合があることが示されているものの，８５アミノ酸長以下である環状ＲＡＰペプチドが，配列番号９７と非常に同一性の高いアミノ酸配列を有していても，アミノ酸の置換位置，アミノ酸長，又は配列番号９７のどの範囲のアミノ酸配列を含むのかによって，所定のＫｄ値を満たさない場合があることが具体的に示されている。また，実施例に示された環状ＲＡＰペプチドのうち所定のＫｄ値を満たすものは，６７〜７５アミノ酸長のもののみで，７６〜８５アミノ酸長又は６６アミノ酸長以下のものは示されていない。さらに，実施例によって示された環状ＲＡＰペプチドのうち所定のＫｄ値を満たすものは，配列番号９７に９８％〜１００％という高率で同一である５０個の連続するアミノ酸を含んでいるもののみである。
ウ 図９には，未環化ＲＡＰペプチドのアミノ酸長及び配列番号９７のどの範囲のアミノ酸配列を含むのかが，ＣＲ含有蛋白との結合親和性に影響することが示されている。しかし，上記２(2)ウのとおり，図９に示されたアミノ酸配列とＫｄ値との関係が，そのまま環状ＲＡＰペプチドにも応用できるというものではない。
エ したがって，「８５アミノ酸長以下である環状」のペプチドが，「配列番号９７に少なくとも７０％同一である５０個の連続するアミノ酸を含」んでいれば，所定のＫｄ値を満たすことを裏付けるのに十分な実施例が記載されているとはいえない。
４ 取消事由３（審決が指摘する技術常識が存在していなかったこと）について原告は，受容体との結合親和性に影響を与えない多数のアミノ酸変異が存在することから，審決の「受容体等に結合するペプチドは，その結合する領域の１〜- 45 -数個のアミノ酸を変異させただけでも，受容体との結合親和性が変化することが本願出願時の技術常識」であるとの指摘は誤りであると主張する。
しかし，審決の上記指摘は，ペプチドが受容体等に「結合する領域」における変異をいうものであり，当該領域以外に受容体との結合親和性に影響を与えない多数のアミノ酸変異が存在することを否定するものではない。
よって，原告の主張には理由がない。
５ 取消事由４（疾患又は障害の処置のための実施例等が記載されていること）について原告は，本願明細書には，疾患又は障害の処置のための本願発明の実施方法及び実施例が詳細に記載されていることも，本願発明が実施可能要件を満たすことの根拠となると主張する。
しかし，本願発明について，本願明細書の発明の詳細な説明が，当業者が製造できるように明確かつ十分に記載されているかを判断するに当たって，発明を実施した物を製造した後の使用についての記載は直接関係しないから，疾患又は障害の処置のための記載によって本願発明の実施可能要件を根拠付けることはできない。
原告の主張には，理由がない。
６ 小括以上より，@ＲＡＰペプチドの受容体結合に関与ないし影響を与えるアミノ酸残基がどこかということが本件出願日当時の技術常識であり，その結合する領域のアミノ酸残基を変異させれば，受容体との結合親和性が変化することが本件出願日の技術常識であったとしても，そのアミノ酸残基を変異させた場合に，結合親和性を向上させる手法は明らかでなく，また，A本願発明で特定されるアミノ酸配列は，５０個の連続するアミノ酸のうち最大１５個のアミノ酸の変異（挿入，欠失又は置換）を許容するものであって極めて多数に及ぶ一方，B本願明細書に記載された本願発明の実施例はわずか３個であって，その内容も，環化のためのシステインの導入を含めた４，５個のアミノ酸置換を行った，「６７〜７５アミノ酸長の環状」のぺ- 46 -プチドで，「配列番号９７に１００％または９８％（１個の変異）同一である５０個の連続するアミノ酸」を含む，配列番号９７と非常に同一性の高いアミノ酸配列を有しているものにすぎないから，本件出願日当時の当業者は，本願発明の環状ＲＡＰペプチドを製造するために，膨大な数の環状ＲＡＰペプチドを製造して３４個のＣＲ含有蛋白との結合親和性を調べるという，期待し得る程度を超える試行錯誤を要するものと認められる。
したがって，本願発明は実施可能要件を欠くものであり，原告の取消事由には，理由がない。
第６ 結論以上のとおり，原告の請求には理由がないからこれを棄却することとし，主文のとおり判決する。
知的財産高等裁判所第２部裁判長裁判官清 水 節裁判官片 岡 早 苗裁判官古 庄 研- 47 -
事実及び理由
全容
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