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| 事件 |
昭和
24年
(行ケ)
10195号
審決取消請求事件
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| 裁判所のデータが存在しません。 | |
| 裁判所 | 知的財産高等裁判所 |
| 判決言渡日 | 2013/02/07 |
| 権利種別 | 特許権 |
| 訴訟類型 | 行政訴訟 |
| 判例全文 | |
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判例全文
平成２５年２月７日判決言渡 同日原本受領 裁判所書記官 平成２４年（行ケ）第１０１９５号 審決取消請求事件 口頭弁論終結日 平成２５年１月１７日 判 決 原 告 株式会社ダナフォーム 同訴訟代理人弁護士 山 上 和 則 藤 川 義 人 同 弁理士 辻 丸 光 一 郎 中 山 ゆ み 吉 田 玲 子 伊 佐 治 創 李 京 佳 被 告 栄研化学株式会社 同訴訟代理人弁護士 永 島 孝 明 安 國 忠 彦 明 石 幸 二 郎 朝 吹 英 太 安 友 雄 一 郎 浅 村 昌 弘 同 弁理士 磯 田 志 郎 浅 村 ｧ 池 田 幸 弘 井 上 慎 一 主 文 原告の請求を棄却する。 訴訟費用は原告の負担とする。 事実及び理由 第１ 請求 特許庁が無効２０１１−８００２１６号事件について平成２４年４月２５日にし た審決を取り消す。 第２ 事案の概要 本件は，原告が，後記１のとおりの手続において，被告の後記２の本件発明に係 る特許に対する原告の特許無効審判の請求について，特許庁が同請求は成り立たな いとした別紙審決書（写し）の本件審決（その理由の要旨は後記３のとおり）には， 後記４のとおりの取消事由があると主張して，その取消しを求める事案である。 １ 特許庁における手続の経緯 被告は，平成１９年４月２３日，発明の名称を「核酸の合成方法」とする特 許出願（特願２００７−１１３５２３号。出願日を平成１１年１１月８日，国内優 先権主張日を平成１０年１１月９日とする特願２０００−５８１２４８号からの分 割出願である特願２００２−１１０５０５号からの再度の分割出願である。）をし， 平成２０年６月１３日，設定の登録（特許第４１３９４２４号。請求項の数は４） を受けた。以下，この特許を「本件特許」といい，本件特許に係る明細書（甲１１） を「本件明細書」という。 原告は，平成２３年１０月２４日，本件特許の請求項１ないし４（全部）に 係る発明（以下，請求項の番号に応じて「本件発明１」ないし「本件発明４」とい い，これらを併せて「本件発明」という。）について特許無効審判を請求し，無効２ ０１１−８００２１６号事件として係属した。 特許庁は，平成２４年４月２５日， 「本件審判の請求は，成り立たない。」旨 の本件審決をし，その謄本は，同年５月８日，原告に送達された。 ２ 特許請求の範囲の記載 本件発明に係る特許請求の範囲の記載は，次のとおりである。なお，文中の「／」 は，原文の改行箇所を示す。 【請求項１】領域Ｆ３ｃ，領域Ｆ２ｃ，および領域Ｆ１ｃを３′側からこの順で含 む鋳型核酸と以下の要素を含む反応液を混合し，実質的に等温で反応させることを 特徴とする，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。／ @）前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基 配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド／A）@）のオリゴヌクレオチ ドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基 配列を含むオリゴヌクレオチド／B）前記Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴ ヌクレオチド／C）@）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補 鎖における任意の領域Ｒ２ｃの３′側に位置する任意の領域Ｒ３ｃに相補的な塩基 配列を持つオリゴヌクレオチド／D）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡ ポリメラーゼ，および／E）要素D）の基質となるヌクレオチド 【請求項２】A）のオリゴヌクレオチドが，@）のオリゴヌクレオチドをプライマ ーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃとその５′側に位置する領域 Ｒ１ｃに対し，前記Ｒ２ｃと相補な塩基配列を持つ領域の５′側に前記Ｒ１ｃと同 じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドで構成されるプライマー である請求項１に記載の方法 【請求項３】以下のオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーを含む，１本鎖上 に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用プライマーセット。／領域Ｆ ３ｃ，領域Ｆ２ｃ，および領域Ｆ１ｃを３′側からこの順で含む鋳型核酸に対し， ／@）前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩 基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド／A）@）のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩 基配列を含むオリゴヌクレオチド／B）前記Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリ ゴヌクレオチド／C）@）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相 補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの３′側に位置する任意の領域Ｒ３ｃに相補的な塩 基配列を持つオリゴヌクレオチド 【請求項４】A）のオリゴヌクレオチドが，@）のオリゴヌクレオチドをプライマ ーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃとその５′側に位置する領域 Ｒ１ｃに対し，前記Ｒ２ｃと相補的な塩基配列を持つ領域の５′側に前記Ｒ１ｃと 同じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドで構成されるプライマ ーである請求項３に記載のプライマーセット ３ 本件審決の理由の要旨 本件審決の理由は，要するに，平成１１年６月２４日出願（パリ条約に基づ く優先権主張日：平成１０年６月２４日，米国）の特願平１１−１７９０５６号（甲 １の４・５。以下「第１出願」という。）の一部が，平成１５年１２月２４日分割出 願されて特願２００３−４２８４８２号（甲１の３。以下「第２出願」という。）と なり，更にこの一部が，平成１７年４月１８日分割出願（甲１の６。以下「第３出 願」といい，第３出願に係る明細書及び図面を「第３明細書」という。）されて特願 ２００５−１２０４０９号となり，平成１７年１０月６日の出願公開（甲１の６） を経て平成２３年２月４日に特許第４６７５１４１号により特許された（甲１の１。 以下，請求項１６及び１７に記載の発明を，請求項の番号に従い，「甲１発明１６」 及び「甲１発明１７」という。 ところ， ） 第１出願の際の明細書及び図面（甲１の５。 以下「第１明細書」という。）及び第２出願の際の明細書及び図面（甲１の３。以下 「第２明細書」という。）には，いずれも甲１発明１６及び１７の一部（後記 参 照）が記載されておらず，これらの各明細書の全ての事項を総合することにより導 かれる技術的事項との関係において，新たな技術的事項を導入するものであるから， 第３出願が，平成２０年法律第１６号による改正前の特許法（以下「法」という。） 44条1項の規定に基づく適法な分割出願とは認められず，出願日が遡及せず実際 の分割出願日（第３出願の日）である平成１７年４月１８日に出願されたものとな るから，甲１発明１６及び１７の出願が，本件出願との関係で先願にはならず，し たがって，本件特許が特許法39条1項の規定に違反してされたものとはいえない， というものである。 甲１発明１６及び１７の特許請求の範囲の記載は，次のとおりである。なお， 後記の下線部は，当裁判所が便宜上付したものであり，原告が本件発明１ないし４ の「アウタープライマー」（以下「ＯＰ」という。）に相当すると主張する部分であ って，かつ，本件審決が第１明細書（甲１の５）及び第２明細書（甲１の３）のい ずれにも記載がないと認定した部分であることを示す。 ア 甲１発明１６（【請求項１６】：キットであって，以下：／第１のオリゴヌク ） レオチドプライマーであって， （@） ／ サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングし， 該サンプル一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第１の一本鎖核酸分子を 合成するための合成起点として働く，３′末端ヌクレオチド配列，および／（A） 該第１の一本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５′末端ヌクレオチド配列を含む， ／第１のオリゴヌクレオチドプライマー；／第２のオリゴヌクレオチドプライマー であって，該サンプル一本鎖核酸分子に該第１のオリゴヌクレオチドプライマーが アニーリングする位置よりも３′側に位置する該サンプル一本鎖核酸分子の領域に アニーリングする，ヌクレオチド配列を含む，第２のオリゴヌクレオチドプライマ ー；／第３のオリゴヌクレオチドプライマーであって，／（@）該第１のオリゴヌ クレオチドプライマーを使用して調製された該第１の一本鎖核酸分子にアニーリン グし，そして該第１の一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第２の一本鎖 核酸分子を合成するための合成起点として働く，３′末端ヌクレオチド配列，およ び／（A）該第２の一本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５′末端ヌクレオチド 配列を含む，／第３のオリゴヌクレオチドプライマー；／鎖置換活性を有するＤＮ Ａポリメラーゼ；ならびに／該プライマーを伸長させるために該ＤＮＡポリメラー ゼによって使用される，１つ以上のヌクレオチド，／を備える，キット イ 甲１発明１７（【請求項１７】：請求項１６に記載のキットであって，／第４ ） のオリゴヌクレオチドプライマー／をさらに備え，該第４のオリゴヌクレオチドプ ライマーは，前記第１の一本鎖核酸分子に前記第３のオリゴヌクレオチドプライマ ーがアニーリングする位置よりも３′側に位置する該第１の一本鎖核酸分子の領域 にアニーリングする，ヌクレオチド配列を含む，／キット ４ 取消事由 甲１発明１６及び１７の先願性の認定の誤り（取消事由１） 法44条の分割要件を判断した誤り（取消事由２） 第３ 当事者の主張 １ 取消事由１（甲１発明１６及び１７の先願性の認定の誤り）について 〔原告の主張〕 第１明細書は，ＳＤＡ法についての説明がある甲１２の１（米国特許第５２ ７０１８４号公報。なお，甲１２の２は，これに対応する特開平５−２７６９４７ 号公報である。 を援用している 【０００６】 ところ， ） （ ） 甲１２の１・２の図１には， ＯＰを用いた増幅反応が記載されている。 また，第１明細書の図１３及び１４に記載のプライマーは，領域Ｆ２ｃ又はＲ２ ｃの３′末端側にアニールするという，本件発明のＯＰの要件を満たしている。な お，本件発明のＯＰは，領域Ｆ２ｃ又はＲ２ｃの３′末端側にアニールすること以 外には規定がないから，例えば，５′末端で２つのオリゴヌクレオチドが連結され， 「 ２つの３′末端を有するという特殊な分子」を除外して考え，あるいは鎖置換相補 鎖合成によって伸長生成物を分離し得るもののみに限定解釈する根拠はない。 さらに，第１明細書の図１及び３には，ターンバックプライマー（以下「ＴＰ」 という。 がテンプレートにハイブリダイズして伸長した後， ） ターンバックしてステ ムループを形成することにより，次のＴＰがテンプレートにハイブリダイズして伸 長し，前のＴＰ伸長鎖が剥がれて１本鎖になり，その１本鎖にリバース側のＴＰが アニールして伸長することにより，ダンベル型中間体が合成され，新たに３′末端 側に形成されたループ部分に初期のＴＰがアニールして伸長することにより次のダ ンベル型中間体が合成される旨の記載があり，ここでは，ＴＰがＯＰと同じ役割を 果たしている。 以上のとおり，第１明細書全体をみれば，そこには本件発明のＯＰが記載されて いることが明らかである。 標 準的なプライマーの定義に関して，第１明細書（【００８７】 ，第２明細 ） 書（【００８８】）及び第３明細書（【００８８】）には，いずれも， 「標準的なプライ マーは，伸長後に合成される配列での二次的構造形成に実質的に関与しないプライ マーである。」との記載があるとおり，標準的なプライマーは，ＰＣＲ法等にも使用 される一般的なプライマーであるところ，ＯＰも，ＰＣＲ法等で使用される一般的 なプライマーであるから，標準的なプライマーがＯＰとして使用可能であることは， 明らかである。 次に，プライマーの数に関して，第１明細書（【００９４】，第２明細書（ ） 【００ ９５】）及び第３明細書（【００９５】）には，いずれも，「単一のプライマーまたは １つより多いプライマーを必要とする」との記載があるとおり，プライマーの数に 制限はなく，通常は，フォワードプライマー及びリバースプライマーの２つのプラ イマーとなるが，これにＯＰを加えて４つのプライマーを使用できることも記載さ れていることになる。 また，プライマーの組合せに関して，第１明細書（【０１２９】，第２明細書（ ） 【０ １３０】）及び第３明細書（【０１３０】）には，いずれも，「プライマーが非直線的 増幅に使用される場合，一方の鎖における結合部位は，第１および第２セグメント を有する新規のプライマーによって使用され，そして他方の鎖における結合部位は， 標準的なプライマーまたは別の新規のプライマーのいずれかによって使用され得 る。， 」「標準的なプライマー，新規のプライマー，構築物および新規の構築物の組合 せもまた，少なくともそれらの１つが第１および第２セグメントを含む限りは，と もに使用され得ることもまた理解される。 との記載があるとおり， 」 標準的なプライ マーと新規なプライマー（ＴＰ）とを組み合わせて使用することが記載されており， その組合せは，フォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せに限定され ないことが明らかである。 そして，鋳型配列とプライマーのアニールに関して，第１ないし第３明細書及び 優先権主張基礎出願（甲１の４）には，いずれも，鋳型配列には領域ＡないしＧと いうサイトごとに記号が付されている図１ないし３が記載されている。そして，上 記図１には，フォワードプライマーとしてＴＰが鋳型配列の領域Ｂにアニールする ことが記載されているが，その領域Ｂの３′末端側に領域Ａが記載されている。こ のサイトがアウタープライマーのアニール可能なサイトであることは，当業者にお いて自明である。同様に，上記図２では，リバースプライマーとして標準的なプラ イマーが領域Ｆ′にアニールし，上記図３では，リバースプライマーとしてＴＰが 領域Ｆ′にアニールしている。そして，上記図２及び３において，リバースプライ マーがアニールする領域Ｆ′の３′末端側の領域Ｇ′が記載されているところ，こ れは，鋳型配列の領域Ｇに由来するものであり，しかも，ＯＰがアニール可能であ ることは，当業者において自明である。また，上記図１ないし３において，意味の ない領域に記号が付されているとは考えらないところ，領域「Ａ」及び「Ｇ」は， ＯＰの使用を前提として記載されていることが明らかである。 さらに，ＯＰについて，第１ないし第３明細書には，いずれも， 「上記初期プライ マーまたは核酸構築物と上記第２のプライマーまたは核酸構築物とは異なり得る。」 （【００１６】）との記載があるところ，上記「第２のプライマー」は，その伸長鎖 （核酸構築物）により上記「初期プライマー」 （ＴＰ）の伸長鎖（核酸構築物）を置 換して剥がす機能を有するものであり，しかも，ＴＰとは異なる核酸配列を有し得 るプライマーであるので，ＯＰであることが明らかである。 以上をまとめると，第１ないし第３明細書には，標準的なプライマーは，Ｏ Ｐとしても機能可能であることが実質的に記載されており，標準的なプライマーと 新規なプライマー（ＴＰ）との組合せは，フォワードプライマー及びリバースプラ イマー以外の組合せも含むことが記載されており，しかも，鋳型配列にＯＰのアニ ールサイトとして機能可能なサイトが記載されている。さらに，第２のプライマー」 「 は，「初期プライマー」（ＴＰ）とは異なる核酸配列を有し得るＯＰであることが記 載されている。したがって，第１ないし第３明細書には，標準的なプライマーが新 規なプライマーのＯＰであることが実質的に記載されているといえる。 よって，第１出願及び第２出願は，いずれも適法な分割出願であるから，甲１発 明１６及び１７の優先権は，有効であって，第１明細書にＯＰが記載されていない と認定し，甲１発明１６及び１７が法44条の分割要件を満たさないとした審決の 判断には，結論に影響を及ぼすことが明らかな重大な誤りがある。 なお，第１明細書の図１に示されているのは，増幅の初期反応であり，それ に引き続き，第１明細書の図に示される本件発明と同じ増幅反応中間体（ダンベル 形中間体）が形成され，非直線的（指数関数的）な増幅反応が生起するもの（【０１ ３３】）であって，当該増幅反応の技術的特徴は，１対（２つ）のＴＰを用いること である。他方，本件発明も，１対（２つ）のＴＰを用いた増幅反応であって，当該 ＴＰは，その伸長鎖に対して５′末端側がターンバック可能であるため，ＯＰを使 用しなかったとしても，当該ターンバックにより次のＴＰが鋳型にアニールして鎖 置換伸長をすることが可能であり，ＯＰと同じように前のＴＰ伸長鎖を鋳型から剥 がして１本鎖にすることができ，当該１本鎖になったＴＰ伸長鎖にリバース側のＴ Ｐがアニールして伸長することにより，非直線的増幅反応のためのダンベル形中間 体が形成されるというものである。このように，甲１発明１６及び１７並びに本件 発明の増幅反応は，いずれも，ＯＰの有無にかかわらず，ダンベル形中間体が形成 されて非直線的な増幅反応が起きるというものであって，その特徴は，２つのＴＰ を用いる点であり，ＯＰの有無は，本質的な相違ではない。したがって，甲１発明 １６及び１７と本件発明とが技術的に相容れないとの被告の主張は，第１明細書の 一部を恣意的に取り上げ，かつ，そこに記載の技術を誤って解釈したものである。 また，当業者は，第１明細書の図１３に示すプライマーが更に伸長することで， 既存の伸長鎖を鋳型から剥がして１本鎖とすること，すなわち，当該プライマーが ＯＰとして機能することを容易に理解できるから，当該プライマーがＯＰとして機 能しないとの被告の主張は，失当である。 〔被告の主張〕 第１明細書に記載の発明は，核酸増幅，核酸配列決定及び重要な特徴を有す る独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供することを目 的とするものである（【００１３】）ところ，その基本原理は，初期プライマー内に 第１のセグメント（領域Ｂ′）及び第２のセグメント（領域Ｃ）を設けることによ り，第２のセグメント（領域Ｃ）と伸長配列の一部（領域Ｃ′）との間で動的平衡 による自己ハイブリダイゼーションをさせて二次構造（鎖内ステムループ構造）を 形成し（図１B） 当該二次構造の形成で１本鎖となった特定の核酸配列の部分に新 ， たな初期プライマーを結合させ（図１C） その伸長により先の伸長プライマーを分 ， 離する（図１D）ことを特徴とする（【００１４】【０１０４】【０１０５】【０１０ ８】。すなわち，上記発明は，動的平衡を利用して，鋳型上で初期プライマー結合 ） 部位を再生することを繰り返すという特徴を有する。他方で，本件発明は，ＯＰを 使用して鋳型と既存のＯＰ伸長生成物とを分離するというものであるから，通常は， プライマー結合部位を再生することはない。このように，第１明細書に記載の発明 は，ＯＰの使用とは技術的に相容れないものであるから，その特徴に鑑みても，第 １明細書にＯＰが記載されていないことは，当然である。 第１明細書が引用する甲１２の１は，ＳＤＡ法という遺伝子増幅方法に関す るものであるから，そこにＯＰが記載されているとしても，それは，ＳＤＡ法にお けるＯＰの使用であるし，ＳＤＡ法と第１出願に係る増幅方法とは，反応機構が異 なるのだから，ＳＤＡ法のＯＰを第１出願に係る増幅方法に使用することはできな い。 次に，第１明細書の図１３及び１４は，３′末端を両端に２つ有する特殊な構造 の１つのプライマーであるから，本件発明の４種類のプライマーを開示するもので はない。また，上記図１３に記載のプライマーは，伸長の結果，伸長生成物の他の 部分が鋳型から分離されているわけではないから，ＯＰとしての機能を全く果たし ていない。また，上記図１３及び１４にＯＰが記載されていると主張する一方で， 第１明細書の図１においてＴＰがＯＰとしての機能を果たしていると主張すること は，論理的な整合性がとれていないし，第１明細書に記載の発明においてＴＰがＯ Ｐとしての機能を果たしていることと，本件発明のように４種類のプライマーのう ちの１つがＯＰであることとは，何ら関連性がない。 さらに，第１明細書の他の部分においても，ＯＰについての言及はなく， 「標準的 なプライマー」がＯＰとして機能できることは，一切記載も示唆もされていない。 このように，第１明細書の全体をみたとしても，そこにはＯＰの記載があるとは いえない。 以上のとおり，第１明細書には，ＯＰの記載はなく，原告の主張に理由がな い。 ２ 取消事由２（法44条の分割要件を判断した誤り）について 〔原告の主張〕 本件審決は，分割要件を満たさないことによる効果が，出願日の遡及が認め られないということであって，必ず無効理由となるわけではないとする。 しかしながら，本件審判において第３出願の要件について審理し，分割要件 を満たさず出願日の遡及が認められないこととなった場合，甲１発明１６及び１７ は，その出願日が平成１７年４月１８日となる結果，本件出願（平成１１年１１月 ８日）の後願となる。そして，本件審決は，甲１発明１６の「第２オリゴヌクレオ チドプライマー」及び甲１発明１７の「第４オリゴヌクレオチドプライマー」がい ずれもＯＰであると認定しているから，本件発明１ないし４と甲１発明１６及び１ ７とが同一の発明であると認定していることになる。したがって，甲１発明１６及 び１７は，特許法39条1項の無効理由を有することが明らかである。 このように，第３出願の要件に関する判断は，甲１発明１６及び１７の無効理由 に直結するため，本件審決による「必ず無効理由となるわけではない」との判断は， 誤りであり，しかも，甲１発明１６及び１７の特許権者に何ら反論の機会を与える ことができない本件審判においてこのような審理をすることは，当該特許権者に不 利益をもたらし，妥当ではない。 本件審決は，分割要件を満たしていない出願について出願日の遡及を認めて， その出願日を基準に後に出願された出願を無効にすることが，特許法の先願主義の 原則に明らかに反するものであるとする。 しかしながら，第３出願の要件については，別途，被請求人（被告）が甲１ 発明１６及び１７に対する無効審判を請求することにより，その無効審判で判断で きるのであるから，本件審決において甲１発明１６及び１７が先願の地位を有する ことを前提として判断しても，先願主義の原則に反するとはいえない。 以上のとおり，本件審決が第３出願の要件を判断したことについては，結論 に影響を及ぼすことが明らかな重大な誤りがある。 〔被告の主張〕 先願発明の分割要件の充足性に関する本件審決及び本件訴訟における判断は，理 由中の判断となり，甲１発明１６及び１７に係る特許の有効性に関して何ら法的な 拘束力を有するものではなく，その特許権者に主張の機会を与えなくても，その利 益が害されることはない。 また，原告の主張に従うならば，引用出願の１つにすぎない甲１発明１６及び１ ７に係る特許に対し，被告が無効審判を請求し，その審決の確定を待たなければ本 件について判断できないこととなり，当事者に過度の手続負担を課し，訴訟経済に 反する結果となる。 したがって，取消事由２に関する原告の主張は，不合理であり，本件審決が第３ 出願の分割要件を判断し得るとした結論に，何ら取消事由はない。 第４ 当裁判所の判断 １ 本件発明について 本件明細書の記載について 本件発明は，前記第２の２に記載のとおりであるところ，本件明細書には，おお むね次の記載がある。 ア 本件発明は，核酸の増幅方法として有用な，特定の塩基配列で構成される核 酸を合成する方法に関する（【０００１】。 ） イ 核酸の塩基配列の相補性に基づく分析方法は，遺伝的な特徴を直接に分析す ることが可能なため，遺伝的疾患等には非常に有力な手段であるが（【０００２】， ） 試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場合の検出は，一般に容易ではなく，標 的遺伝子そのもの等を増幅することが必要となる。ＰＣＲ法は， における 核酸の増幅技術として，現在最も一般的な方法であるが，実施のために特別な温度 調節装置が必要であるし（【０００３】，１塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析では，誤っ ） て混入した核酸を鋳型として相補鎖合成が行われた場合，誤った結果を与える原因 となるので，ＰＣＲ法をＳＮＰｓの検出に利用するには，特異性の改善が必要とさ れている（【０００４】 。ＬＣＲ法も，合成した相補鎖と鋳型との分離に温度制御が ） 必要であり（【０００５】，ＳＤＡ法は，温度制御を省略できるが（ ） 【０００６】， ） 鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼに加えて，ニックをもたらす制限酵素を組み合わせ る必要があり，コストアップの要因となっているほか，一方の鎖には酵素消化に耐 性を持つように基質としてｄＮＴＰ誘導体を利用しなければならないので，増幅産 物の応用が制限される（【０００７】 。さらに，ＮＡＳＢＡ法は，複雑な温度制御を ） 不要とするが，複数の酵素の組合せが必須であり，コストの面で不利であるし，複 数の酵素反応を行わせるための条件設定が複雑なので，一般的な分析方法として普 及させることは，難しい。このように，公知の核酸増幅反応においては，複雑な温 度制御の問題点や複数の酵素が必要となることといった課題が残されている【００ （ ０８】。 ） ウ 本件発明の課題は，新規な原理に基づき，低コストで効率的に配列に依存し た核酸の合成を実現することができる方法，すなわち，単一の酵素を用い，しかも， 等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を達成することができる方法の提供である。 さらに，本件発明は，公知の核酸合成反応原理では達成することが困難な高い特異 性を実現することができる核酸の合成方法及びこの合成方法を応用した核酸の増幅 方法の提供を課題とする（【００１４】。 ） エ 本件発明の発明者らは，鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼの利 用が，複雑な温度制御に依存しない核酸合成に有用であることに着目し（【００１ ５】，従来技術とは異なる角度から合成起点となる３′−ＯＨの供給について検討 ） した結果，特殊な構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用することによって，付加 的な酵素反応に頼らずとも３′−ＯＨの供給が可能となることを見出し，本件発明 を完成した（【００１６】。 ） オ 本件発明が合成の目的としている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結 された核酸とは，１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合わせに連結した核酸 を意味する。さらに，本件発明は，相補的な塩基配列の間にループを形成するため の塩基配列を含まなければならないが，これをループ形成配列と呼ぶ。本件発明に よって合成される核酸は，実質的に，上記ループ形成配列によって連結された互い に相補的な塩基配列で構成される（【００２５】。すなわち，本件発明における１本 ） 鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸とは，同一鎖上でアニールすること が可能な相補的な塩基配列を含み，そのアニール生成物は，折れ曲がったヒンジ部 分に塩基対結合を伴わないループを構成する１本鎖核酸と定義することもできる （【００２６】。 ） カ 本件発明の特徴となっている，３′末端に同一鎖上の一部領域Ｆ１ｃにアニ ールすることができる領域Ｆ１を備え，この領域Ｆ１が同一鎖上の領域Ｆ１ｃにア ニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成する ことができる核酸は，様々な方法によって得ることができる。最も望ましい態様に おいては，少なくとも，特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的な塩基配 列を持つ領域Ｘ２及び当該領域Ｘ２ｃの５′末端側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的 に同じ塩基配列を持つ領域Ｘ１ｃとで構成され，領域Ｘ２の５′末端側に領域Ｘ１ ｃが連結されたオリゴヌクレオチドを利用した，相補鎖合成反応に基づいてその構 造を与えることができる（【００３２】。 ） 本件発明に基づくオリゴヌクレオチドとしては，３′末端側から領域Ｆ２−Ｆ１ ｃを備えるＦＡと，同じく領域Ｒ２−Ｒ１ｃを備えるＲＡとがあるが（【００５３】 【００５４】，まず，鋳型となる核酸（３′末端側からＦ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ− ） 鋳型領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３）の領域Ｆ２ｃに対してＦＡの領域Ｆ２をアニールさ せ，これを合成起点として相補鎖合成を行う。次に，３′末端側から領域Ｆ３を有 するアウタープライマーを鋳型となる核酸の領域Ｆ３ｃにアニールさせ，鎖置換型 の相補鎖合成をＤＮＡポリメラーゼで行うことにより，ＦＡから合成した相補鎖は， 置換され，塩基対結合が可能な状態となる（【００５５】図１）。そして，リバース プライマーとしてのＲＡの領域Ｒ２が，塩基対結合が可能となったＦＡの領域Ｒ２ ｃにアニールして相補鎖合成が，ＦＡの５′側末端である領域Ｆ１ｃに至る部分ま で行われる。この相補鎖合成反応に続いて，やはり置換型のアウタープライマーＲ ３がアニールし，鎖置換を伴って相補鎖合成を行うことにより，ＲＡを合成起点と して合成された相補鎖が置換される。このとき置換される相補鎖は，ＲＡを５′末 端側に持ち，ＦＡに相補的な配列が３′末端に位置する（【００５６】図２）。 なお，鋳型とすべき核酸が２本鎖である場合には，少なくともオリゴヌクレオチ ドがアニールする領域を塩基対結合が可能な状態とする必要があり，そのためには， 一般に加熱変性が行われるが，これは，反応開始前の前処理として一度だけ行えば よい（【００６３】。 ） キ 本件発明において，３′末端側から領域Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを，５′末 端側から領域Ｒ３−Ｒ２を備える鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃに対して，３′末端 側から領域Ｆ２−Ｆ１ｃを備えるＦＡオリゴヌクレオチドをアニールして，鋳型と なる核酸の５′末端側に向かう相補鎖合成の起点とし，次に，鋳型となる核酸の領 域Ｆ３ｃに対して，３′末端側に領域Ｆ３を備えるオリゴヌクレオチドをアニール して，ＦＡオリゴヌクレオチドにより形成された相補鎖を置換し，ＦＡオリゴヌク レオチドを１本鎖（Ａ）とした上で，更に当該ＦＡオリゴヌクレオチドの３′末端 側の領域Ｒ２ｃに対応する領域Ｒ２から相補鎖合成を行うと，合成された核酸は， ３′末端側から領域Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを持つことになる。この核酸をさらにア ウタープライマーによりＲ３を起点とする相補鎖合成によって置換して１本鎖とし， ３′末端が塩基対結合が可能な状態となると，３′末端側の領域Ｆ１は，同一鎖上 のＦ１ｃにアニールし，自己を鋳型とした伸長反応が進む（Ｂ）。そして，上記３′ 末端側に位置する領域Ｆ２ｃを塩基対結合を伴わないループとして残す。このルー プには上記ＦＡオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２がアニールし，これを合成起点とす る相補鎖合成が行われる（Ｂ）。このとき，先に合成された自身を鋳型とする相補鎖 合成反応の生成物が，鎖置換反応によって置換され塩基対結合が可能な状態となる （【００４５】図５）。上記ＦＡオリゴヌクレオチドを１種類及びこれをプライマー として合成された相補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリバース プライマーを用いた基本的な構成によって，複数の核酸合成生成物を得ることがで きる。すなわち，上記ＦＡオリゴヌクレオチドにより置換された鋳型となる核酸の ３′末端にある領域Ｒ１ｃに対して，３′末端側に領域Ｒ１を備えるＲＡオリゴヌ クレオチドをアニールさせ，ＦＡオリゴヌクレオチドを置換することで，合成の目 的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸（Ｄ）が生じ る。他方，上記置換によって１本鎖となったＦＡオリゴヌクレオチドにより形成さ れた相補鎖にＲＡオリゴヌクレオチドがアニールし，相補鎖合成が行われることに よって２本鎖となった生成物（Ｅ）は，加熱変性などの処理によって１本鎖とすれ ば，再び（Ｄ）を生成するための鋳型となる。また， （Ｄ）は，加熱変性などによっ て１本鎖にされた場合，もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖内部でのアニ ールが起こり，上記（Ｂ）の状態に戻るので，更にそれぞれが１分子ずつの（Ｄ） 及び（Ｅ）を与える。これらの工程を繰り返すことによって，１本鎖上に相補的な 塩基配列が交互に連結された核酸を次々に合成していくことが可能である。１サイ クルで生成される鋳型と生成物が指数的に増えていくので，たいへん効率的な反応 となる（【００４６】図６）。ところで上記（Ａ）の状態を実現するためには，はじ めに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマーがアニールする部分におい て塩基対結合が可能な状態にしなければならない。このステップは，任意の方法に よって達成できる。すなわち，最初の鋳型に対してＦＡオリゴヌクレオチドがアニ ールする領域Ｆ２ｃよりも更に鋳型上で３′末端側の領域Ｆ３ｃにアニールするア ウタープライマー（Ｆ３）を別に用意し，これを合成起点として鎖置換型の相補鎖 合成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行えば，上記領域Ｆ２ｃを合成 起点として合成された相補鎖は，置換され，やがて領域Ｒ２がアニールすべき領域 Ｒ２ｃを塩基対結合が可能な状態とする。鎖置換反応を利用することによって，こ こまでの反応を等温条件下で進行させることができる（【００４７】図５）。 ク 本件発明において，１本鎖核酸の３′末端側には，同一鎖上の領域Ｆ１ｃに 相補的な領域Ｆ１が存在するので，当該領域Ｆ１と領域Ｆ１ｃとは，速やかにアニ ールして相補鎖合成が始まるが，その際，領域Ｆ２ｃが塩基対結合が可能な状態で 維持されたループを形成する。そして，上記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ 本件発明のオリゴヌクレオチドＦＡは，上記ループ部分にアニールして，相補鎖合 成の起点となり，先に開始した領域Ｆ１からの相補鎖合成の反応生成物を置換しな がら進む結果，自身を鋳型として合成された相補鎖は，再び３′末端において塩基 対結合が可能な状態となる。この３′末端は，同一鎖上の領域Ｒ１ｃにアニールし 得る領域Ｒ１を備えており，やはり同一分子内の速やかな反応により，両者は，優 先的にアニールする。このようにして，本件発明による１本鎖上に相補的な塩基配 列が交互に連結された核酸は，次々と相補鎖合成と置換とを継続し，その３′末端 Ｒ１を起点とする伸長を続けることになるが，当該３′末端Ｒ１の同一鎖へのアニ ールによって形成されるループには常に領域Ｒ２ｃが含まれることから，以降の反 応で３′末端のループ部分にアニールするのは，常に領域Ｒ２を備えたオリゴヌク レオチドＲＡとなる（【００５７】。一方，自分自身を鋳型として伸長を継続する１ ） 本鎖の核酸に対して，そのループ部分（領域Ｆ２ｃ）にアニールするオリゴヌクレ オチドを合成起点として相補鎖合成される核酸（ＦＡ）に着目すると，ここでも， 本件発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成が進行 している。そして，この核酸の合成によって置換された核酸が（領域Ｒ２ｃを含む ループを経て）相補鎖合成を開始すると，やがてその反応は，かつて合成起点であ ったループ部分（領域Ｆ２ｃ）に達して再び置換が始まる。こうして，ループ部分 （領域Ｆ２ｃ）から合成を開始した核酸も，置換され，その結果，同一鎖上にアニ ールすることができる３′末端Ｒ１を得て，当該３′末端Ｒ１は，同一鎖の領域Ｒ １ｃにアニールして，次の相補鎖合成を開始する（【００５８】。このように，本件 ） 発明においては，１つの核酸の伸長に伴って，これとは別に伸長を開始する新たな 核酸を供給し続ける反応が進行し，更に，鎖の伸長に伴い，末端のみならず，同一 鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのループ形成配列は，鎖置換 反応により塩基対形成可能な状態となると，オリゴヌクレオチドがアニールし，新 たな核酸の生成反応の起点となる。末端のみならず，鎖の途中からの合成反応も組 み合わされることにより，更に効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上の ようにリバースプライマーとして本件発明に基づくオリゴヌクレオチドＲＡを組み 合わせることによって，伸長とそれに伴う新たな核酸の生成が起きる。さらに，本 件発明においては，この新たに生成した核酸自身が伸長し，それに付随する更に新 たな核酸の生成をもたらすが，一連の反応は，理論的には永久に継続し，極めて効 率的な核酸の増幅を達成することができるし，本件発明の反応は，等温条件のもと で行うことができる（【００５９】。 ） ケ 本件発明の方法により蓄積する反応生成物は，領域Ｆ１−Ｒ１間の塩基配列 とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。ただし，繰り返し単位となってい る配列の両端には，領域Ｆ２−Ｆ１（領域Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ）又は領域Ｒ２−Ｒ１（領 域Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃ）の塩基配列で構成される領域が連続している。これは，本件発 明に基づく増幅反応が，オリゴヌクレオチドを合成起点として領域Ｆ２又はＲ２か ら開始し，続いて自身の３′末端を合成起点とする領域Ｆ１又はＲ１からの相補鎖 合成反応によって伸長するという原理のもとに進行しているためである（【００６ ０】。 ） コ 一連の反応は，鋳型となる１本鎖の核酸に対して，４種類のヌクレオチド（Ｆ Ａ，ＲＡ，アウタープライマーＦ３及びアウタープライマーＲ３），鎖置換型の相補 鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチ ドを加え，ＦＡ及びＲＡを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩 基対結合を形成することができ，かつ，酵素活性を維持し得る温度でインキュベー トするだけで進行する（【００６２】。したがって，ＰＣＲ法のような温度サイクル ） は必要ない（【００６３】。 ） サ 本件発明による核酸の合成方法を支えているのは，鎖置換型の相補鎖合成反 応を触媒するＤＮＡポリメラーゼであるが，そのようなものとして知られているポ リメラーゼ（１１種類の既存のポリメラーゼを列挙。【００７６】）のうち，Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等は，ある程度の耐熱性を持ち，触媒活性も高いことから特に 望ましい酵素である。本件発明の反応は，望ましい態様においては等温で実施する ことができるが，融解温度の調整などのために必ずしも酵素の安定性に相応しい温 度条件を利用できるとは限らないから，酵素が耐熱性であることは，望ましい条件 の一つである。また，等温反応が可能とはいえ，最初の鋳型となる核酸の提供のた めにも加熱変性は行われる可能性があり，その点においても耐熱性酵素の利用は， アッセイプロトコールの選択の幅を広げる（【００７７】。 ） シ 本件発明による核酸の合成方法又は増幅方法に必要な各種の試薬類は，あら かじめパッケージングしてキットとして供給することができる。具体的には，本件 発明のために，相補鎖合成のプライマーとして，あるいは置換用のアウタープライ マーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド，相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ， 鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ，酵素反応に好適な条件を与える 緩衝液，更に必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類で構成され るキットが提供される。特に，本件発明の望ましい態様においては，反応途中で試 薬の添加が不要なことから，１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で 供給することにより，サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とすることがで きる。発光シグナルや蛍光シグナルを利用して反応生成物の検出を反応容器のまま で行えるようなシステムとすれば，反応後の容器の開封を全面的に廃止することが できる（【００８０】 。 ） ス 本件発明の特徴は，ごく単純な試薬構成で容易に達成できることにある。例 えば，本件発明によるオリゴヌクレオチドは，特殊な構造を持つとはいえ，それは， 塩基配列の選択の問題であって，物質としては単なるオリゴヌクレオチドである。 また，望ましい態様においては，鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリ メラーゼのみで反応を進めることができるなど，全ての酵素反応を単一の酵素によ って行うことができる。したがって，本件発明による核酸合成方法は，コストの点 においても有利である。このように，本件発明の合成方法及びそのためのオリゴヌ クレオチドは，操作性（温度制御不要），合成効率の向上，経済性そして高い特異性 という，複数の困難な課題を同時に解決する新たな原理を提供する（【００２４】。 ） 本件発明の構成及び合成反応について ア 本件発明を構成するオリゴヌクレオチド（プライマー）等について 本件発明１における鋳型核酸は，A）において「@）のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃ」とされているので， 領域Ｒ２ｃに相補的な領域Ｒ２を有しており，また，C）において， 「@）のオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの ３′末端側に位置する任意の領域Ｒ３ｃ」とされているので，領域Ｒ３ｃに相補的 な領域Ｒ３を領域Ｒ２の５′末端側に有していることが理解できる。したがって， 鋳型核酸は，３′末端側から順に領域Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを有するとともに， ５′末端側から順に領域Ｒ３−Ｒ２を含むものといえる。しかし，本件発明２にお いては， 「@）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における 任意の領域Ｒ２ｃとその５′末端側に位置する領域Ｒ１ｃ」と特定されているので， 本件発明２の鋳型核酸は，５′末端側から順に領域Ｒ３−Ｒ２−Ｒ１を有するもの である。 また，@）のオリゴヌクレオチドは， 「前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域 の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含む」ものであるの で，３′末端が領域Ｆ２であり，５′末端が領域Ｆ１ｃであるプライマーである。 A）のオリゴヌクレオチドは， 「領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列を含む」ものであ るので，３′末端が領域Ｒ２であるプライマーであるが，当該領域Ｒ２よりも５′ 末端側の塩基配列は，特定されていないから，当該部分には任意の領域が存在する ことが可能である。しかし，本件発明２においては，（A）のオリゴヌクレオチド 「 が…前記Ｒ２ｃと相補的な塩基配列を持つ領域の５′側に前記Ｒ１ｃと同じ塩基配 列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドで構成されるプライマー」と特定 されているので，本件発明２のA）のオリゴヌクレオチドは，３′末端が領域Ｒ２ であり，その５′末端側に領域Ｒ１ｃを有するものである。 B）のオリゴヌクレオチドは， 「Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つ」ものであるの で，３′末端が領域Ｆ３であるプライマーである。 C）のオリゴヌクレオチドは， 「領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つ」ものであ るので，３′末端が領域Ｒ３であるプライマーである。 そして，本件発明３及び４は，それぞれ，本件発明１及び２の特許請求の範囲に 記載された核酸等を備えたプライマーセットである。 イ 本件発明の合成反応について 本件発明１は，前記アに記載のオリゴヌクレオチド（プライマー）等を「混合し， 実質的に等温で反応させることを特徴とする，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互 に連結された核酸の合成方法」であるが，その特許請求の範囲の記載からは，上記 オリゴヌクレオチド（プライマー）等がどのような合成反応により上記「１本鎖上 に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」を合成するに至るのかは，一義的に 明確とはいえず，このことは，本件発明１を引用する本件発明２においても同様で ある。 そこで，前記 に記載の本件明細書の記載を参酌し，併せて，本件優先権主張日 当時の当業者の技術常識であったと認められる，@１本鎖の核酸の特定の領域の塩 基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを，当該領域にアニールさ せて２本鎖とすることができること，AＤＮＡポリメラーゼの機能によって，部分 的に２本鎖となった鋳型核酸の３′末端が鋳型核酸の１本鎖となっている部分に対 して相補鎖合成を行うということ， B特定のＤＮＡポリメラーゼが触媒となって， 他の核酸にアニールしたオリゴヌクレオチドの３′末端が塩基対結合の置換による 相補鎖合成反応を示すこと（前記 エ及びサ参照）を考慮すると，例えば本件発明 ２は，次の合成反応を想定しており，後記 オ 以降の反応により， 「１本鎖上に相補 的な塩基配列が交互に連結された核酸」が得られるものと認められる（なお，本件 発明の特許請求の範囲の記載との対比から，本件明細書の上記部分並びに図５及び ６における「Ｒ１」及び「Ｒ１ｃ」は，いずれも「Ｒ２」及び「Ｒ２ｃ」の誤記で あると認める。。 ） ア 反 応１：鋳型核酸に@）のオリゴヌクレオチドがアニールし，鋳型核酸と それに相補的な塩基配列を有する核酸の２本鎖が得られる。 イ 反 応２：前記反応１で得られた２本鎖の末端で１本鎖となっている鋳型核 酸の領域Ｆ３ｃにB）のオリゴヌクレオチドがアニールし，先に合成された相補鎖 を置換しながら相補鎖合成が進行する結果，@）のオリゴヌクレオチドが１本鎖と なる。 ウ 反 応３：前記反応２で得られた１本鎖核酸の領域Ｒ２ｃにA）のオリゴヌ クレオチドがアニールし，当該１本鎖の核酸の領域Ｒ２ｃの５′末端側の塩基配列 に対する相補鎖が合成され，当該核酸とそれに相補的な塩基配列を有する核酸の２ 本鎖が得られる。 エ 反 応４：前記反応３で得られた２本鎖の末端で１本鎖となっている領域Ｒ ３ｃにC）のオリゴヌクレオチドがアニールし，先に合成された相補鎖を置換しな がら相補鎖合成が進行する結果，A）のオリゴヌクレオチドが１本鎖となる。 オ 反 応５：前記反応４で得られた１本鎖は，３′末端側から順に領域Ｆ１− Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを有するので，当該領域Ｆ１と領域Ｆ１ｃとがアニールしてループ を形成し，次いで，当該３′末端から当該１本鎖の核酸の領域Ｆ１ｃの５′末端側 の塩基配列に対する相補鎖が合成される結果，当該塩基配列とそれに相補的な塩基 配列が１本鎖上に領域Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃのループを介して交互に連結した核酸 （「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」）が得られる。また，前 記反応４で得られた１本鎖は，５′末端側から順に領域Ｒ１ｃ−Ｒ２−Ｒ１を有す るので，この反応５で得られた核酸は，３′末端側から順に領域Ｒ１−Ｒ２ｃ−Ｒ １ｃを有する。 カ 反 応６：前記反応５で得られた核酸のループ部分の領域Ｆ２ｃに@）のオ リゴヌクレオチドがアニールし，当該核酸の塩基対結合を置換しながら，当該核酸 の領域Ｆ１ｃの５′末端側の塩基配列に対する相補鎖が合成される。 キ 反 応７：前記反応６の相補鎖合成反応によって塩基対結合が可能となった ３′末端は，領域Ｒ１と領域Ｒ１ｃとがアニールしてループを形成し，次いで，当 該３′末端から当該１本鎖の核酸の領域Ｒ１ｃの５′末端側の塩基配列に対する相 補鎖が合成され，その際，前記反応６で形成された２本鎖が置換される結果，当該 塩基配列とそれに相補的な塩基配列が１本鎖に領域Ｒ１−Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃのループ を介して交互に連結した核酸を介して交互に連結した核酸「１本鎖上に相補的な塩 （ 基配列が交互に連結された核酸」）が得られる。 ク 反応８：前記反応７によって得られた核酸のループ部分の領域Ｒ２ｃにB） のオリゴヌクレオチドがアニールし，当該核酸の塩基対結合を置換しながら，当該 核酸の領域Ｒ１ｃの５′末端側の塩基配列に対する相補鎖が合成され，この合成反 応における鋳型核酸の３′末端がループを形成して，当該ループ部分からの相補鎖 合成が進行する。以下，ループ部分へのB）のオリゴヌクレオチドのアニールと， ループ部分からの相補鎖合成が進行することにより，１本鎖上に，相補的な塩基配 列の交互の連結が繰り返された核酸が得られる。 ケ 反 応９：前記反応７によって置換されて１本鎖となった核酸は，３′末端 側から順に領域Ｒ１−Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃを有し，また，５′末端側から順に領域Ｆ１ ｃ−Ｆ２−Ｆ１を有することから，当該核酸を新たな鋳型とした前記反応５ないし ８が繰り返される。 本件発明の課題，課題解決手段及び作用効果について 以上のとおり，本件発明の特許請求の範囲の記載及び本件明細書の記載によれば， 本件発明１を引用する本件発明２は，核酸の合成に当たり，従来技術では，複雑な 温度調節又は複数の酵素の組合せが必要であったという課題を解決するため，本件 発明２の構成，特に，３′末端側から領域Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを備え，５′末 端側から領域Ｒ３−Ｒ２−Ｒ１を備える鋳型となる核酸を基にして，これに特定の 領域を備えたオリゴヌクレオチド及び鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡ ポリメラーゼ等を混合することで，当該オリゴヌクレオチドの反応により，１本鎖 上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を，等温条件かつ単一の酵素を利用 するだけで合成させることを可能とし，これによって操作性，合成効率の向上，経 済性及び高い特異性を実現するという作用効果を有するものであって，本件発明４ は，本件発明２の課題解決手段によって，上記核酸を合成するプライマーセットを 実現するものであるといえる。 そして，本件発明の合成反応におけるB）及びC）のオリゴヌクレオチドは，前 記 イ イ （ 反応２）及び エ （反応４）において，その伸長反応によって，@） 及びA）のオリゴヌクレオチドを起点として合成された相補鎖を置換し，当該相補 鎖を確実に１本鎖の核酸にするというアウタープライマーとしての役割を果たすも のである。 ２ 取消事由１（甲１発明１６及び１７の先願性の認定の誤り）について 甲１発明１７と本件発明４との同一性について ア 甲１発明１６及び１７は，前記第２の３ に記載のとおりであるが，サンプ ル一本鎖核酸分子，第１ないし第３のオリゴヌクレオチドプライマー（甲１発明１ ７は，これに加えて第４のオリゴヌクレオチドプライマー） 鎖置換活性を有するＤ ， ＮＡポリメラーゼ及び当該プライマーを伸長させるために当該ＤＮＡポリメラーゼ によって使用される１つ以上のヌクレオチドを備えるキットについての発明である。 このように，甲１発明１７は，４種類のオリゴヌクレオチドプライマーを備える キットに係る発明であるところ，本件発明２は，核酸の合成方法に係る発明であり， 本件発明４は，４種類のオリゴヌクレオチドを用いた本件発明２の方法を採用した プライマーセットであるから，以下では，オリゴヌクレオチドの数及び発明の形態 が共通する本件発明４と甲１発明１７の同一性について検討する。 イ 本件発明４の鋳型核酸は，前記１ ア に記載のとおり，３′末端側から順に 領域Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃを有するとともに，５′末端側から順に領域Ｒ３−Ｒ ２−Ｒ１を有するものであるから，３′末端側から，領域Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ −鋳型となる領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３を有する。そこで，甲１発明１７のサンプル 一本鎖核酸分子の構成は，特許請求の範囲の記載では特定されていないが，第１明 細書に記載の別紙図１を参考にして，本件発明４との対比のため，３′末端側から 順に領域Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇを有するものであるとする。すなわち，領域 Ｆ３ｃは，領域Ａに，領域Ｆ２ｃは，領域Ｂに，領域Ｆ１ｃは，領域Ｃに，鋳型と なる領域は，領域Ｄに，領域Ｒ１は，領域Ｅに，領域Ｒ２は，領域Ｆに，領域Ｒ３ は，領域Ｇに，それぞれ対応するものである。 ウ 甲１発明１６及び１７の特許請求の範囲の記載によれば，前記第１のオリゴ ヌクレオチドプライマーは， 「サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングし，該サンプ ル一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第１の一本鎖核酸分子を合成する ための合成起点として働く，３′末端ヌクレオチド配列」を有するから，当該配列 を領域Ｂ′とすると，ここにいう「第１の一本鎖核酸分子」は，５′末端側から順 に，第１のオリゴヌクレオチドプライマー−Ｃ′−Ｄ′−Ｅ′−Ｆ′−Ｇ′の領域 を有することとなる。また，第１のオリゴヌクレオチドプライマーは， 「該第１の一 本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５′末端ヌクレオチド配列」を有するところ， 当該配列を領域Ｃとすると，３′末端が領域Ｂ′であり，５′末端が領域Ｃとなる。 他方，本件発明４の@）のオリゴヌクレオチドは，前記１ ア に記載のとおり， ３′末端が領域Ｆ２（領域Ｂ′に対応）であり，５′末端が領域Ｆ１ｃ（領域Ｃに 対応）であるから，上記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの構成と一致する。 エ 甲１発明１７における第２のオリゴヌクレオチドプライマーは，該サンプル 「 一本鎖分子に該第１のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置より も３′側に位置する該サンプル一本鎖核酸分子の領域にアニーリングする，ヌクレ オチド配列」を有するので，第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３′末端の配 列は，領域Ａ′となる。 他方，本件発明４のB）のオリゴヌクレオチドは，前記１ ア に記載のとおり， ３′末端が領域Ｆ３（領域Ａ′に対応）であるから，上記第２のオリゴヌクレオチ ドプライマーの構成と一致する。 オ 甲１発明１７における第３のオリゴヌクレオチドプライマーは，該第１のオ 「 リゴヌクレオチドプライマーを使用して調製された該第１の一本鎖核酸分子にアニ ーリングし，そして該第１の一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第２の 一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く，３′末端ヌクレオチド配列」 を有するところ，当該領域をＦとすると，ここにいう「第２の一本鎖核酸分子」は， ３′末端側から順に，Ｃ′−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−第３のオリゴヌクレオチドプライマ ーの領域を有することとなる。また，第３のオリゴヌクレオチドプライマーは， 「該 第２の一本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５′末端ヌクレオチド配列」を有す るところ，当該配列をＥ′とすると，３′末端が領域Ｆであり，５′末端が領域Ｅ′ となる。 他方，本件発明４のA）のオリゴヌクレオチドは，前記１ ア に記載のとおり， ３′末端が領域Ｒ２（領域Ｆに対応）であり，５′末端が領域Ｒ１ｃ（領域Ｅ′に 対応）であるから，上記第３のオリゴヌクレオチドプライマーの構成と一致する。 カ 甲１発明１７における第４のオリゴヌクレオチドプライマーは，前記第１の 「 一本鎖核酸分子に前記第３のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位 置よりも３′側に位置する該第１の一本鎖核酸分子の領域にアニーリングする，ヌ クレオチド配列」を有するので，第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３′末端 の配列は，領域Ｇとなる。 他方，本件発明４のC）のオリゴヌクレオチドは，３′末端が領域Ｒ３（領域Ｇ に対応）であるから，上記第４のオリゴヌクレオチドプライマーの構成と一致する。 キ 本件発明４は， １本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成 「 用プライマーセット」であるところ，甲１発明１７のキットを使用して得ることが できる物質は，その特許請求の範囲の記載では特定されていない。 しかしながら，前記イないしカに説示のとおり，甲１発明１７における４種類の オリゴヌクレオチドプライマーと本件発明４におけるオリゴヌクレオチドとは，共 通する特定の領域を有する鋳型核酸（サンプル一本鎖核酸分子）に対して，いずれ も相対的に共通する領域を有するものである。これに加えて前記１ イの本件優先 権主張日当時の当業者の技術常識を考慮すると，本件発明４及び甲１発明１７は， そのプライマーセット又はキットを使用して核酸を合成した場合に，同一のものを 得ることができるものと認められる。 したがって，甲１発明１７は，キットの用途が特定されていないものの，当該特 定の有無は，本件発明４との相違点とはならない。 ク 以上によれば，本件発明４は，甲１発明１７と同一の発明であるといえる。 第１明細書について 第１明細書には，別紙図１ないし３，１３及び１４のほか，おおむね次の記載が ある。 ア 「特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスであって，以下の工 程： 該特定の核酸配列， 該特定の核酸配列についての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって， 該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が，以下の２つのセグメント： （Ａ）第１のセグメントであって， （@）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的 に相補的であり，そして（A）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る，セグメ ント，および， （Ｂ）第２のセグメントであって， （@）該第１のセグメントに実質的に非同一で あり，そして（A）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり， （B）該 第２のセグメントの相補的配列に結合し得，そして（C）第２のプライマー伸長が 生成されて第１のプライマー伸長を置換するように，均衡または限定サイクリング 条件下で，続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの，該特定 の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る，セグメント，を含む；ならびに， 該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物であっ て，該続く初期プライマーまたは該核酸構築物が，以下の２つのセグメント， （Ａ）第１のセグメントであって， （@）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的 に相補的であり，そして（A）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る，セグメ ント，および， （Ｂ）第２のセグメントであって， （@）該第１のセグメントに実質的に非同一で あり，（A）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり，（B）該第２の セグメントの相補的配列に結合し得，そして（C）第２のプライマー伸長が生成さ れ，そして第１のプライマー伸長を置換するように，均衡または限定サイクリング 条件下で，続くプライマーの第１のセグメントの，該特定の核酸配列の該第１の部 分への結合を提供し得る，セグメント，を含む：ならびに基質，緩衝液，およびテ ンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに， 均衡または限定サイクリング条件下で，該基質，緩衝液，またはテンプレート依 存性重合化酵素の存在下で，該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸 構築物をインキュベートし；それにより，該特定の核酸配列を非線形に増幅する， 工程，を包含する，プロセス。（ 」【請求項１２】） イ 本発明は，組換え核酸技術の分野に関し，より詳細には，核酸増幅，核酸配 列決定のための終結後標識及び減少した熱力学安定性を有する核酸の生成のための プロセスに関する（【０００１】。 ） ら によって記載される鎖置換増幅法（ＳＤＡ法）は，プライマー内の制 限酵素部位の封入によって行われ，その結果，制限酵素による消化は，単一の温度 で所定のテンプレートからの，一連のプライミング，伸長及び置換反応を可能にす る。しかし，これらの系は，ポリメラーゼ及び基質のほか，プライミングが行われ る部位での適切な制限酵素部位の存在，第２の酵素（制限酵素）の存在及び特異的 に改変された基質が必要となる。この方法のバリエーションが記載されており（米 国特許第５２７０１８４号（甲１２の１），本明細書中で参考として援用する。，こ ） こで，標的における制限酵素部位の必要性の限定が，制限酵素部位を有するプライ マーに隣接する第２のプライマーセットの使用によって排除されている。しかし， このバリエーションにおいて，系は，第２のプライマーセットについての必要性の 新たな限定を有する一方，制限酵素及び改変基質についての他の２つの限定が必要 であることが記載されている（【０００６】。 ） 本発明では，均衡条件」 「 とは，実質的に定常な温度及び／又は化学条件をいい【０ （ ０８１】， ）「限定サイクル条件」とは，使用される最高温度が，そのテンプレートか ら伸長プライマーを分離するのに必要な温度以下である一連の温度をいい【００８ （ ２】， ）「初期プライマー」とは，伸長されていないプライマー又はプライマー構築物 をいい（【００８６】 ， ） 「標準的なプライマー」とは，伸長後に合成される配列での 二次構造形成に実質的に関与しないプライマーをいう（【００８７】 。 ） ウ 本発明は，特定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスを提供する。この プロセスにおいては，増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列，第 １初期プライマー（以下「第１プライマー」という。，後続の初期プライマー（以 ） 下「第２プライマー」という。，基質，緩衝液及びテンプレート依存性ポリマー化 ） 酵素が提供される。第１プライマー及び第２プライマーは，いずれも， （@）特定の 核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり， （A）テンプレート依存性第１伸長 が可能であると特徴付けられる第１セグメントのほか， （@）第１セグメントと実質 的に同一でない，（A）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である，（B）第 ２セグメントの相補配列に結合し得る， （C）均衡又は限定サイクル条件下で，第１ プライマー又は第２プライマーの第１セグメントの，特定の核酸配列の第１部分へ の続く結合を提供し得る，という４つの特徴を備える第２セグメントを含む。この ような条件下及び方法において，先に伸長したプライマーを置換するために，次の プライマー伸長を生成する。このプロセスを行うために，特定の核酸配列及び新規 のプライマーが，基質，緩衝液及びテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で， 均衡又は限定サイクル条件下で，インキュベートされることにより，目的の特定の 核酸配列が非直線的に増幅される（【００７４】【０１１２】【０１１３】。 ） エ 本発明の特定の局面において，新規のプライマーは，少なくとも，テンプレ ートに結合し得，そして伸長のためにそれを使用し得る第１セグメント，及び目的 の標的の配列に実質的に同一であり，第１セグメントの伸長配列との自己ハイブリ ダイゼーションによって形成される二次構造の形成を可能にする第２セグメントの， ２つのセグメントを含む 【００９４】。 （ ） 本発明における新規のプライマーのテンプ レート依存性伸長は，自己ハイブリダイゼーションによって形成されるステムルー プ構造及び新規のプライマーを含む配列に同一又は相補的でない伸長配列を有する 産物を作製し得る（【０１０３】。この産物は，図１に例示され，そこにおける二次 ） 構造の形成は，テンプレートからの，伸長した新規のプライマーの第１セグメント の全て又は一部の除去を提供し得る（【０１０４】。 ） オ 前記のとおり，新規のプライマーの結合及び伸長は，均衡又は限定サイクル 条件下で，複数のプライマー結合及び伸長事象についてのテンプレートの使用を可 能にし得る。新規の結合及び伸長事象は，以前にそのテンプレートに対して伸長し ている核酸鎖の分離を可能にするため，変性事象に必要ではない第２プライマーの 結合についてのテンプレートとして使用され得る１本鎖核酸鎖の生成を生じる。テ ンプレート依存性結合及び伸長の最終産物は，一方のプライマーが標準的なプライ マーであり，他方が新規のプライマーである場合，一方の末端が各鎖のステムルー プ構造を含む２本鎖分子であり得，両方のプライマーが新規のプライマーである場 合，各末端において各鎖のステムループ構造を含む２本鎖分子（図３C）であり得 る（【０１３０】 。非直線的増幅産物は，均衡又は限定サイクル条件下で，連続した ） 一連の以下の工程によって，新規のプライマー及び標準的なプライマーによって合 成され得る。まず，図１の直線的増幅があり，テンプレートから第１伸長プライマ ーが分離する。新規のプライマーは，他方の新規のプライマーの連続する結合及び 伸長によって置換されるので，これらの１本鎖産物は，標準的なプライマーに結合 し得，そしてそれらを伸長させて，完全な２本鎖アンプリコンを作製し得る。この 潜在的な一連の事象を，図２に示す。次いで，１本鎖ループ構造におけるプライマ ー結合部位の露出は，図１において以前に示した同じプロセスによって，更なる一 連のプライマー結合及び置換反応をもたらす（【０１３１】。非直線的増幅産物は， ） また，均衡又は限定サイクル条件下で，２つの第１セグメント及び１つの第２セグ メントを含む新規の核酸構築物によって合成され得る。第１セグメントの各々には， 核酸の鎖又はその相補体に相補的であり，第２セグメントは，第１セグメントの１ つの伸長後に，二次構造を形成し得る。この構築物は，一対の相補的な潜在的ステ ムループ構造を有する産物を作製し得る。この産物は，連続する一連の以下の工程 によって形成され得る。まず，図１の直線的増幅があり，テンプレートから第１伸 長プライマーが分離する。さらに，この合成の産物は，一連の結合及び伸長工程の ためのテンプレートとして，新規のプライマーでの非直線的増幅について上（図２） に記載されているような他方の第１セグメントによって使用され得る。これらの工 程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態の一つが，図３である（【０１３３】。 ） カ 図１は，新規のプライマーによる直線的増幅を示す模式図である。図２は， 新規のプライマー及び標準的なプライマーによる非直線的増幅を示す模式図である。 図３は，一対の新規のプライマーによる非直線的増幅を例示する模式図である。図 １３は，非直線的に増幅し得る２つの３′末端を有する新規の核酸構築物について の別の設計の例示を示す模式図であり，図１４は，図１３に示されるプロセス及び 事象の続きを示す模式図である。 「二次構造」の意義について 第１明細書にいう「二次構造」とは，前記 エ及び図１の記載によれば，ステム ループ構造と同義であり，図１BないしD，図２@及びBないしD並びに図３@， B及びCにおいて，領域Ｃ−Ｂ′−Ｃ′，領域Ｃ−Ｂ−Ｃ′，領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′ 及び領域Ｅ−Ｆ−Ｅ′により形成されるループ部分を意味するものと認められる。 第１明細書に記載された発明について ア 前記 ア，ウ及びオに記載のとおり，第１明細書には，「該特定の核酸配列 についての第１の初期プライマーまたは核酸構築物」 （第１プライマー）及び「該特 定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物」第２プライ （ マー）を使用した特定の核酸配列を非直線的に増幅する方法が記載されている。 第１明細書及び図面の記載によれば，第１プライマーは，第１のセグメントとし て鋳型核酸のある領域に相補的な配列を当該プライマーの３′末端に有し，第２の セグメントとして鋳型核酸中の当該領域よりも５′末端側にある領域と実質的に同 一であり，かつ，第１のセグメントの配列とは実質的に非同一である配列を有する ものと認められ，第２プライマーは，第１のセグメントとして特定の核酸配列の相 補体，すなわち，第１プライマーによる伸長物のある領域に相補的な配列を３′末 端に有し，第２のセグメントとして当該第１プライマーによる伸長物中の当該領域 よりも５′末端側にある領域と実質的に同一であり，かつ，第１のセグメントの配 列とは実質的に非同一である配列を有するものと認められる。そして，上記増幅方 法は，前記 ア 及びオ（【請求項１２】【０１３３】）に記載のとおり，第１プライ マーを用いた直線的な増幅工程（図１）に，第２プライマーを加えた非直線的な増 幅工程（図３）を組み合わせたものである。 イ そして，本件優先権主張日当時の当業者は，第１明細書の記載から，第１明 細書【請求項１２】【０１３３】及び図１ないし３に記載の核酸の増幅方法として， 次の方法を読み取ることができたものと認められる。 まず，図１に記載の前記直線的な増幅工程は，@３′末端側から領域ＡないしＧ を有する鋳型核酸と，３′末端に第１のセグメントとして鋳型核酸の領域Ｂに相補 的な塩基配列Ｂ′を有し，５′末端に第２のセグメントとして鋳型核酸の領域Ｃと 同一の塩基配列Ｃを有する第１プライマーを準備し，第１プライマーを鋳型核酸に アニールさせる（図１@） A第１プライマーにより鋳型核酸の塩基配列に対する相 ， 補鎖が合成され，２本鎖の核酸が得られる（図１A），B第１プライマーの５′末端 側にある領域Ｃ及びＣ′が自己ハイブリダイゼーションを生じ，二次構造（ステム ループ構造）が形成されると同時に，鋳型核酸に１本鎖の部分が再生される（図１ B）C第１プライマーを上記Bの鋳型核酸に再生された１本鎖の部分にアニールさ ， せる（図１C），D上記Cの２番目の第１プライマーが，５′末端側に二次構造を有 する１番目の第１プライマーを置換する，という工程からなる。 次に，図２及び３に記載の前記非直線的な増幅工程は，E３′末端に第１セグメ ントとして，上記Dで置換されて分離された５′末端側に二次構造を有する１番目 の第１プライマーの伸長物の領域Ｆ′に相補的な塩基配列Ｆを有し，５′末端に第 ２のセグメントとして当該第１プライマーの伸長物の領域Ｅ′と同一の塩基配列 Ｅ′を有する第２プライマーを準備し，これを当該第１プライマーにアニールさせ る（図３@） F第２プライマーにより上記第１プライマーの塩基配列に対する相補 ， 鎖が合成され，２本鎖の核酸が得られる（図３A），G上記Fで得られた２本鎖核酸 中の自己ハイブリダイゼーション可能な領域で自己ハイブリダイゼーションが生じ， 二次構造（ステムループ構造）が形成される（図３B），H上記Gで形成された二次 構造のループ部分のうち，領域Ｂを含むものに第１プライマーをアニールさせる（図 ２C参照）I上記Hでアニールした第１プライマーからの相補鎖合成及び置換によ ， り，各末端において各鎖のステムループ構造を含む２本鎖分子（図３C。ダンベル 型中間体）が得られるほか，上記Eで用いられた５′末端側に二次構造を有する１ 番目の第１プライマーの伸長物が分離されて得られる，という工程からなる。 したがって，上記EないしIの反応を繰り返すことで，ダンベル型中間体を非直 線的に増幅することが可能となる。 第１明細書の記載と甲１発明１７の対比等について ア 前記 ウ及びエに記載のとおり，甲１発明１７における第１のオリゴヌクレ オチドプライマーがサンプル一本鎖核酸分子の領域Ｂにアニールするとき，第２の オリゴヌクレオチドプライマーは，該サンプル一本鎖分子に該第１のオリゴヌクレ 「 オチドプライマーがアニーリングする位置よりも３′側に位置する該サンプル一本 鎖核酸分子の領域にアニーリングする，ヌクレオチド配列」を有するので，その３′ 末端の配列は，領域Ａ′となる。しかしながら，第１明細書には，３′末端の配列 が領域Ａ′であり，サンプル一本鎖核酸分子の領域Ａにアニールする上記第２のオ リゴヌクレオチドプライマーについての記載はない。 また，前記 オ及びカに記載のとおり，甲１発明１７における第３のオリゴヌク レオチドプライマーが第１の一本鎖核酸分子の領域Ｆ′にアニールするとき，第４ のオリゴヌクレオチドプライマーは，前記第１の一本鎖核酸分子に前記第３のオリ 「 ゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置よりも３′側に位置する該第１ の一本鎖核酸分子の領域にアニーリングする，ヌクレオチド配列」を有するので， その３′末端の配列は，領域Ｇとなる。しかしながら，第１明細書には，３′末端 の配列がＧであり，第１の一本鎖核酸分子の領域Ｇ′にアニールする上記第４のオ リゴヌクレオチドプライマーについての記載はない。 そして，前記 エ及びカに記載のとおり，甲１発明１７の第２のオリゴヌクレオ チドは，本件発明４のB）のオリゴヌクレオチド（ＯＰ）と一致し，甲１発明１７ の第４のオリゴヌクレオチドは，本件発明４のC）のオリゴヌクレオチド（ＯＰ） と一致するものであるから，第１明細書には，本件発明４のB）及びC）の各オリ ゴヌクレオチド（ＯＰ）に対応する記載がないというほかない。 イ また，第２及び第３明細書における甲１発明１６及び１７の記載の有無並び に手続補正の内容は，次のとおりである。 ア 第 １出願の出願人は，平成１５年１２月２４日，第２出願をして第２明細 書を提出したが，第２明細書の記載は，第１明細書とほぼ同じであって，甲１発明 １６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーについての記 載はない（甲１の３）。 イ 第 １及び第２出願の出願人は，平成１７年４月１８日，第３出願をして第 ３明細書を提出したが，第３明細書の記載は，第１明細書とほぼ同じであって，甲 １発明１６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーについ ての記載はない。なお，第３出願に係る特許請求の範囲は，次の請求項１だけであ った（甲１の６）。 【請求項１】特定の核酸配列を直線的に増幅するためのプロセスであって，以下の 工程：／１）該特定の核酸配列，／初期プライマーまたは核酸構築物であって，以 下の２つのセグメント：／（Ａ）第１のセグメントであって， （@）該特定の核酸配 列の第１の部分と結合またはハイブリダイズするに十分に，該部分と相補的であり， そして（A）テンプレート依存性の伸長を提供する，セグメント，および／（Ｂ） 第２のセグメントであって，@） （ 該第１のセグメントと実質的に非同一であり，A） （ 該特定の核酸配列の第２の部分と実質的に同一であり， （B）該特定の核酸配列の第 １の相補的コピーが該第１のセグメントのテンプレート依存性伸長により生成され た後に，均衡条件下または限定サイクリング条件下で，該第２のセグメントの相補 的な配列に結合し，そしてそれにより（C）その後の別の該初期プライマーまたは 核酸構築物の第１のセグメントの，該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を均 衡条件下または限定サイクリング条件下で提供し，プライマー伸長の後に第２の相 補的コピー生成されて該第１の相補的コピーを置換するようにする，セグメントを 含む，初期プライマーまたは核酸構築物；ならびに，／基質，緩衝液，およびテン プレート依存性重合化酵素；を提供する工程；ならびに，／２）均衡条件下または 限定サイクリング条件下で，該基質，緩衝液，およびテンプレート依存性重合化酵 素の存在下で，該特定の核酸配列と，該新規プライマーまたは核酸構築物とをイン キュベートし；それにより，該特定の核酸配列を直線的に増幅する工程，／を包含 する，プロセス ウ 第１ないし第３出願の出願人は，平成２０年３月２４日，手続補正を行い， 第３出願に係る特許請求の範囲を全面的に改めて請求項の数を２６にした（甲５。 以下「本件補正」という。。本件補正に係る請求項２４及び２５は，明らかな誤記 ） を除き，甲１発明１６及び１７と同一である。 エ 第 １ないし第３出願の出願人は，平成２１年１２月２５日，手続補正を行 い，第３出願に係る特許請求の範囲を改めて請求項の数を１８にしたため，本件補 正に係る前記請求項２４及び２５は，請求項１６及び１７となった（甲１０）。さら に，上記出願人は，平成２２年５月７日，請求項１６及び１７（甲１発明１６及び １７）について前記明らかな誤記を訂正する手続補正をした（甲７）。 オ 甲 １発明１６及び１７を含む第３出願については，平成２２年１２月２２ 日に特許査定がされ，その登録は，平成２３年２月４日にされた（甲１の１・２）。 ウ 以上によれば，甲１発明１６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレ オチドプライマーは，いずれも第１ないし第３明細書には記載がなく，本件出願日 （平成１１年１１月８日）に後れる本件補正（平成２０年３月２４日）によって第 ３出願の特許請求の範囲に付加されたものと認められる。 原告の主張について ア 原告は，第１明細書が援用する甲１２の１にはＯＰを用いた増幅反応が記載 されていると主張する。 確かに，甲１２の１には，２つのプライマーが，他のプライマーにより合成され た相補鎖を置換し，当該相補鎖を１本鎖の核酸にするＯＰとして機能する工程を含 む核酸の増幅反応が記載されているといえる。しかしながら，甲１２の１に記載さ れた増幅反応は，鎖置換型増幅法（ＳＤＡ法）であるのに対し，第１明細書に記載 された発明は，ＳＤＡ法とは異なる増幅方法である。したがって，第１明細書に甲 １２の１を援用する旨の記載があるからといって，そこに記載されたＯＰが第１明 細書に記載された発明の一部となるものではない。 よって，原告の上記主張は，採用することができない。 イ 原告は，第１明細書の図１３及び１４に記載のプライマーが本件発明のＯＰ の要件を満たしていると主張する。 確かに，第１明細書の図１３@には，３′末端側からから領域ｃ′ｄ′ｂａｃ′ を有するプライマーと，３′末端側から領域ｇ′ｈ′ｆｅｇ′を有するプライマー とが，両者の５′末端同士で結合した２つの３′末端を有するプライマーが記載さ れており，図１３Aには，このプライマーが，５′末端側から領域ａないしｈを有 する鋳型核酸にアニールした図が記載されている。そして，図１３Bでは，相補鎖 合成が進行した図が示され，図１３Cでは，伸長した鎖が鋳型から分離された図が 示されている。しかしながら，分離された鎖を示す図１３Cには，領域ｆ′ｅ′し か示されておらず，それに引き続くべき領域ｄ′以下が記載されていないことに照 らすと，これらの図において，上記プライマーのうち領域ｇ′ｈ′からの伸長は， これらの領域が合成された後に鋳型の領域ｅに対する相補鎖（領域ｅ′）が合成さ れた時点で停止しており，当該プライマーからの別の伸長鎖を鋳型から分離させて いるものとは認められない。むしろ，図１３Cは，プライマーに由来する核酸の相 補鎖合成が図１３Bに示された状態で停止したことが記載されており，かつ，この 核酸については，図１３DないしFにステムループ構造からの自己複製をすること が記載されているから，当業者は，図１３Bに示された状態から，更に相補鎖合成 が進行することを想定できない。 したがって，図１３には，先の工程で合成された相補鎖を鋳型から分離するとい う機能を有するＯＰが記載されているものとは認められない。図１４についても， 相補鎖合成が途中で停止しており，図１３の場合と同様に，ＯＰが記載されている ということはできない。 したがって，原告の上記主張を採用することはできない。 ウ 原告は，第１明細書の図１及び３の増幅反応ではＴＰがＯＰと同じ役割を果 たしているので，第１明細書にはＯＰが記載されていると主張する。 しかしながら，第１明細書に記載された発明では，前記(4)イに記載のとおり，第 １プライマーは，先に合成された相補鎖を１本鎖にするという役割を果たしている （工程D）ものの，そこで使用される第１プライマー（ＴＰ）は，５′末端側に， 第２のセグメントとして鋳型核酸の領域と同一の領域Ｃを有するものであり，その ため，当該第１プライマーを起点として合成された相補鎖は，その５′末端側にあ る領域Ｃ及びＣ′が自己ハイブリダイゼーションを生じ，二次構造（ステムループ 構造）を形成するものである。 このように，第１明細書に記載された第１プライマー（ＴＰ）は，ＯＰとしての 役割を果たすほかにも，５′末端に鋳型核酸の領域と同一の領域Ｃを有するため， 二次構造（ステムループ構造）を形成するという役割も果たすものであり，後者の 役割は，先に合成された相補鎖を１本鎖にするというＯＰとは，その構造も機能も 異なるものである。 したがって，第１プライマー（ＴＰ）は，ＯＰとしての機能のみを有するもので はなく，むしろ，二次構造（ステムループ構造）を形成することでその後の増幅反 応の工程に影響を与えるものであるから，第１プライマーの記載があるからといっ て，直ちに第１明細書にＯＰが記載されているということはできない。 よって，原告の上記主張は，採用することができない。 エ 原告は，第１明細書に記載の「標準的なプライマー」が，その定義からＯＰ として使用可能であると主張する。 しかしながら，第１明細書において標準的なプライマーを使用する具体例は，新 規なプライマー（第１プライマー）と標準的なプライマーを使用した場合の非直線 的増幅方法として図２に示された方法であるところ，当該方法においては，標準的 なプライマーは，鋳型となる核酸にアニールした後，単に鋳型核酸の相補鎖を合成 するのみであり，先に合成された相補鎖を１本鎖にするというＯＰとしての機能を 果たすものではない。また，他に標準的なプライマーがＯＰとしての機能を果たす ことは，第１明細書には記載がなく，示唆もされていない。 よって，原告の上記主張は，採用することができない。 オ 原告は，第１明細書では使用するプライマーの数に制限なく，フォワード及 びリバースの２つのプライマーにＯＰを加えて，４つのプライマーを使用できるこ とが記載されていることになると主張する。 しかしながら，第１明細書には，フォワード及びリバースの２つのプライマーに ＯＰを加えて，４つのプライマーを使用することは明記されていない。 また，第１明細書に記載された発明は，前記(4)イに説示のとおり，第１プライマ ーの５′末端側にある領域Ｃ及びＣ′が自己ハイブリダイゼーションを生じ，二次 構造（ステムループ構造）が形成されると同時に，鋳型核酸に１本鎖の部分が再生 され（図１B），再生された鋳型核酸の当該１本鎖の部分に，第１プライマーがアニ ールする（図１C）ことを特徴とするものであり，図１に示された工程を繰り返す ことにより，鋳型核酸と第１のプライマーを原料とし，図２又は図３@に示された 二次構造（ステムループ構造）を有する核酸を直線的に増幅すると同時に，鋳型核 酸を原料として再利用できるように回収するものである。ここで，第１明細書に記 載された増幅反応において，ＴＰに代えてＯＰを使用するということは，鋳型核酸 の１本鎖の部分のいずれかの領域（図１Bの領域ＡないしＣ）にＯＰを結合させる というものであるところ，このような場合，鋳型核酸とＯＰによる伸長鎖からなる ２本鎖核酸が合成されるが，生成した２本鎖の核酸は，等温条件下では１本鎖核酸 に解離できないので，以降の核酸の増幅に関与することができなくなる。すなわち， 第１明細書の図１に示された増幅反応において，ＯＰを使用した場合，鋳型核酸を 原料として再利用できず，１本鎖の鋳型核酸が使用し尽くされたところで増幅反応 は停止し，図２又は図３@に示された二次構造（ステムループ構造）を有する核酸 を十分な量で得ることができなくなる。 そうすると，このように核酸を十分な量で得られなくなるような技術的思想が， 特定の核酸配列を非直線的に増幅しようとする発明に関する第１明細書に開示され ているとは認められず，原告の上記主張は，採用することができない。 カ 原告は，第１明細書（【０１２９】）には標準的なプライマーと新規なプライ マー（ＴＰ）とを組み合わせて使用することが記載されており，その組合せは，フ ォワード及びリバースのプライマーの組合せに限定されないと主張する。 しかしながら，第１明細書には，フォワード側又はリバース側のプライマーとし て，標準的なプライマーと新規なプライマー（ＴＰ）を組み合わせて使用すること までは記載されていないし，これらのプライマーの組合せがフォワード側及びリバ ース側のプライマーの組合せに限定されないからといって，直ちに第２及び第４の オリゴヌクレオチドプライマー又はその技術的思想が第１明細書に開示されている ということにはならない。 よって，原告の上記主張は，採用することができない。 キ 原告は，第１明細書の図１ないし３に記載の領域Ａ及びＧは，ＯＰがアニー ル可能なサイトであり，また，意味のない領域に記号が付されているとは考えられ ないことから，領域Ａ及びＧの記載は，ＯＰの使用を前提とするものである旨を主 張する。 しかしながら，原告が指摘する鋳型核酸における領域Ａ及びＧは，第１明細書に 記載された第１プライマーの第２セグメントが有する領域（領域Ｃ又はＥ′）が， 鋳型核酸における領域（領域Ａ及びＧ）と同じではないことを説明するために記号 が付されていると理解するのが自然であって，意味のない領域に記号が付されてい るものでない。そして，前記オにも説示したとおり，ＴＰに代えて領域Ａ及びＧに アニールするＯＰを使用した場合，得られる核酸の量が減少するため，このような ＯＰを使用するという技術的思想が第１明細書に開示されているということはでき ない。 よって，原告の上記主張は，採用することができない。 ク 原告は，第１明細書（【００１６】）に記載された第２プライマーがＯＰであ ると主張する。 しかしながら，第２プライマーは， 「第２のプライマーまたは核酸構築物の第１の セグメントの，続く該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る」【０ （ ０１４】）と記載されているように，特定の核酸配列の第１の部分，すなわち，図１ に示された鋳型核酸の領域Ｂに結合するものであるところ，前記オに説示したとお り，当該領域にＴＰに代えてＯＰが結合した場合には，鋳型核酸を原料として再利 用できず，このようなＯＰを使用するという技術的思想が第１明細書に開示されて いるということはできない。 よって，原告の上記主張は，採用できない。 (7) 小括 以上のとおり，甲１発明１６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレオチ ドプライマーは，本件発明４のB）及びC）のオリゴヌクレオチドに相当するもの であって，本件発明１ないし３もそのいずれかを備えるものであるものの，いずれ も第１ないし第３明細書には記載がなく，本件出願日（平成１１年１１月８日）に 後れる本件補正（平成２０年３月２４日）によって第３出願の特許請求の範囲に付 加されたものであって，第１ないし第３明細書の全ての記載を総合することにより 導かれる技術的事項との関係において新たな技術的事項を導入するものというべき であるから，第１ないし第３明細書に記載した事項の範囲内のものとはいえない。 したがって，特許法39条1項の適用に当たって，上記第２及び第４のオリゴヌク レオチドプライマーを含む甲１発明１６及び１７が第１出願の日（平成１１年６月 ２４日）又はその優先権主張日（平成１０年６月２４日）に特許出願がされたもの とみる余地はなく，本件発明の先願発明とはいえないことが明らかであって，本件 審決は，結論において相当である。 ３ 取消事由２（法44条の分割要件を判断した誤り）について 原告は，本件審決が甲１発明１６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレ オチドプライマーについて，第３出願における分割要件を満たさないと判断したこ とについて，結論に影響を及ぼすことが明らかな重大な誤りであると主張する。 しかしながら，本件においては，特許法39条1項の適用に当たって，甲１発明 １６及び１７が本件発明の先願発明といえるか否かが問題となっているところ，本 件発明の特許法39条1項に関する適合性が争われた無効審判請求の審判手続及び 審決取消訴訟において，特許庁又は裁判所が本件発明と甲１発明１６及び１７との 先後関係を審理することができることは，当然である。そして，前記のとおり，甲 １発明１６及び１７における第２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーは，本 件出願日（平成１１年１１月８日）に後れる本件補正（平成２０年３月２４日）に よって第３出願の特許請求の範囲に付加されたものであって，第１ないし第３明細 書に記載した事項の範囲内のものではなく，甲１発明１６及び１７は，第１出願の 日又はその優先権主張日に特許出願がされたものとみる余地がないから，甲１発明 １６及び１７が本件発明の先願発明とはいえないことが明らかである。 したがって，本件審決が，甲１発明１６及び１７が本件発明の先願発明といえる か否かの判断に当たって法44条に言及したことは，措辞不適切の余地があるとは いえるものの，結論に影響を及ぼすものではない。 よって，原告の前記主張は，採用することができない。 ４ 結論 以上の次第で，原告主張の取消事由にはいずれも理由がないから，原告の請求は 棄却されるべきものである。 知的財産高等裁判所第４部 裁判長裁判官 土 肥 章 大 裁判官 井 上 泰 人 裁判官 荒 井 章 光 別紙 １ 図１ ２ 図２ ３ 図３ ４ 図１３ ５ 図１４ |